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一：核酸的提取和纯化S)Xw'
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（一）DNA的提取和纯化+'&k-1
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1.质粒提取OA
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1.1导论F+xnqn
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已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA， 这些方法都含有以下3个步骤：s?5
细菌培养物的生长、细菌的收获和裂解、质粒DNA的纯化 3N#5
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1.1.1细菌培养物的生长 U
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从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。c iRUb
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1.1.2细菌的收获和裂解vO?
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细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。X{mz@
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。4TY
2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。,
3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。8oWJ
4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。J@a
５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。n
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1.1.3质粒DNA的纯化 y=<
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常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。另外，现在已可买到现成的纯化KIT。{:A~)
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1.2质粒DNA的小量制备I+YD0V
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质粒ＤＮＡ的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法mD
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1.2.1细菌的收获和裂解vY
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１．收获s
１）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。G6y>1Q
２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。lP
３）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。HBnhzp
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２．碱裂解法9<
１）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。G;c*->
溶液ＩIm[c
50mmol/L葡萄糖O3{
25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)dR=-Fy
10mmol/LEDTA(pH8.0)>{M?%*
溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。<=I7
２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。h8;#\
溶液ⅡF^4eZ
0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）k
1%SDS©食品论坛 -- 关注食品安全，探讨食品技术，汇聚行业英才，推动行业发展。 u
盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面-(J"
均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。-
３）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ (iX.m
溶液Ⅲg
5mol/Ｌ乙酸钾 60mlkU
冰乙酸 11.5mlMj[BAP
水 28.5ml\
所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。*A 1
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后"g)AO
将管置于冰上３－５分钟。>MJ
４）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。cTH8{
５）可做可不做：加等量酚：氯念， 振荡混匀， 用微量离心机于4 ℃以12000g离心w5
２分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。~L
６）用２倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合， 于室温放置２分钟。R?|LTM
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心５分钟。44pY1n
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。)/i
９）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。{v
i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。,W B(
ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶， 在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。[
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：Z
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３．煮沸裂解/
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１）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。OwIS
STET©食品论坛 -- 关注食品安全，探讨食品技术，汇聚行业英才，推动行业发展。 Rh&;
0.1mol/L NaCL(o
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)KGQBML
1mmol/L EDTA(pH8.0)o+
5% Triton X-100^OwDO(
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。:&5jO
３）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。!GI
４）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。N9:<L
５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。dPzN
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。VdbZ>I
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。m
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。Re|?V
９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心２分钟。&26)D
10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。J_Za%
11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。Q8J/:
注：当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。Me
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1.2.2质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策 ^a
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裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：(wDB
１）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。A%
２）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。 !d!
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1.3质粒ＤＮＡ的大量制备E
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1.3.1在丰富培养基中扩增质粒C
许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。0>n^
１）将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。H%5c1r
２）将含相应抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分），所得培养物的OD 600值约为0.4。?%
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。U"p1
４）于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。:.>oH8
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1.3.2细菌的收获和裂解9
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１．收获Z0r
１）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。"ZSPJ
２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。]~{}
STE©食品论坛 -- 关注食品安全，探讨食品技术，汇聚行业英才，推动行业发展。 c;v'Z!
0.1mol/L NaClT&GC!@
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)lqEn
1mmol/L EDTA(pH8.0)H#]
3）按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。?.
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２，碱裂解法?(
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１）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。n4R
溶液Ｉk,
50mmol/L葡萄糖B00u
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)Mwq]l?
10mmol/L EDTA(pH8.0)dYjx
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于４℃。j`(
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。/
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。D0S
溶液Ⅱiq
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）Wla6
1％SDS\?}IP
盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。8n}>
４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。6
溶液Ⅲ@kAr
5mol/L乙酸钾 60mlT.t
冰乙酸 11.5ml]h
水 28.5ml?vtBI
所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。;
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。&O
５）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤４）]。7CZ &l
６）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。5Z#
７）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。Q|M(
８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。w
９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。m4|
10）纯化。j\eB
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1.4质粒ＤＮＡ的纯化6R|>o
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1.4.1聚乙二醇沉淀法提取质粒ＤＮＡar
１）将核酸溶液所得]转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于４℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。qY
２）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。&OUs6
３）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。cu
４）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。?
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。G%H2N
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。>%N?a
７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。Oht
８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。AZKeg
９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。n/c]k
10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE（pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。RfA7_c
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（二）氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环ＤＮＡ/,>uw
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此方法可获的较高质量的质粒DNA，但耗时且费用昂贵目前较少采用，这里不多缀述。,;]5C
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2 石蜡包埋组织的DNA提取=T]bW,
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近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。~{Z$
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对开矿学延伸。通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要， 结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。p>#}l)
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2.1 石蜡包埋组织DNA提取的基本方法@
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从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。 首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。xtjDRQ
Goelz氏DNA提取方法的主要步骤Rih$k?
1.切除多余石错，暴露组织qg
2.将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；k
3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h]94WU[
ＴＥ９提取液的制备v
500mmol/L Trisvz
20mmol/L EDTAu$/
10mmol/L NaClSKUr
1％ SDSc$
500 μg/ml 蛋白酶Ｋ<+;
pH8.0©食品论坛 -- 关注食品安全，探讨食品技术，汇聚行业英才，推动行业发展。 ZQ4
4.再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h；jN6t7`
5.用等体积酚－氯仿溶液抽提３次；g
6.2.5倍体积乙醇沉淀DNANg
7.-70℃放置２－４hTBvIL`
8.9 000xg离心１h{j
9.沉淀物用70％乙醇洗１次~$
10.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。 dU
不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。Southern 印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Slebos,et al,1990；Smit, et al, 1988 ）、 蛋白酶消化法（Impraimet al.1987；Brice,et al.1989）。]
这些方法不经过酚－氯仿－异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min 或在蛋白酶Ｋ缓冲液中消化４h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增， 但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且征对性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和与引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。 t
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2.2 影响DNA提取质量的因素M
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1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。Barmwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel's运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量得明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg，高于新鲜标本（19.4/mm3）。[*aU
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经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特性卫星带，说明DNA被完全消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至－20℃过夜。然后再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2－3h，石蜡包埋。结果显示，每10mgAMex法处理的温重组织提得高分子量DNA71.4?4.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4?3.76μg）。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对开矿学、免疫表型和基因改变的相关分析。z
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2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生的，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定时是一个重要的变异因素。然而，Goelz等，没有发现固定时间对DNA提取量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8％。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30％，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应模索选定。根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110h之内。>Gm]
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3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接的互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时，产生两条单链分子。最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构改变。当pH达到2.5惟下时，几乎所有碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N－糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最多，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而，既使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。0aw
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4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量晨100bp－10000bp之间，主要分布于100－1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关以外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短下一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的地间长短不一。虽然本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA弯性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。X+B8s
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2.3 提高DNA提取质量的方法{@V
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1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。Wqg8a
2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消地间的DNA纯化等问题上取得了进展。①DNA提取液主要为含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DNA与蛋白质不易分离。因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1％-2％，蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba等尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2－巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2－羟基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得了高质量DNA。②DNA释放率对于不同蝗组织类型是有差异的，最决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏），通过24h孵育80％以上DNA可释放出来；相同量的DNA释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质，DNA释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织DNA提取，蛋白酶K的孵育时间可作适当调整，以求大量地获取大分子DNA。此外，对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。③Dubeau等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的DNA，可通过搅起完整的DNA而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在DNA纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的量，杂交分析显示，螺旋化DNA杂交信号强，而未螺旋化DNA信号减弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。但是，Moerkert等认为未螺旋化DNA不影响进行点杂交分析。L4/
3．免疫DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切在3－5μm薄片，使每一细胞都被切开但是，我们认为切片太薄，容易对过多地将DNA切断，影响高分子DNA的获得率。最好是采用15－20μm的厚切片，高浓度蛋白酶K消2－4天，使能达到细胞充分破碎、蛋白肖化的目的。并尽可能避免机械性匀浆过程造成的DNA剪切。此外，在DNA释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的DNA剪切。纯化DNA用TE（pH8.0）溶解放4℃保存即可，若短其不用时应-20℃冻存，但切忌反复冻融，以免DNA降解。z
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