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免疫荧光组织(细胞)化学染色方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2013-08-02  来源:实验室资讯网  浏览次数:506
核心提示:免疫荧光组织(细胞)化学染色方法:直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法:直接法

基本原理
 
将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
 
试剂与仪器
 
磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
 
荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释
 
缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
 
搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
 
有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
 
荧光显微镜
 
玻片架
 
滤纸H
 
37℃温箱等。
 
实验步骤
 
1、滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。
 
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。
 
3、取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。
 
4、取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
 
5、立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
 
(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。
 
注意事项
 
1、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。
 
2、染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
 
3、为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
 
(1) 标本自发荧光对照:标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。
 
(2) 特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。
 
(3) 阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
 
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。
 
4、一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。
 
 免疫荧光组织(细胞)化学染色方法:间接法
一、原理与意义
 
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法——间接法,是一种荧光抗体染色法。该方法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,敏感性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。
 
二、操作流程
 
(一)双层法(Double Layer Method)
 
1、切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH7.2 PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。
 
2、再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。
 
3、对照染色
 
①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。
 
②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。
 
③阳性对照。
 
(二)夹心法:未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:
 
1、切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。
 
2、滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。
 
3、缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。
 
4、滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。
 
5、如③水洗。
 
6、缓冲甘油封固,镜检并拍照。

免疫荧光组织(细胞)化学染色方法:补体法
一、原理与意义
 
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法——补体法,是一种荧光抗体染色法。本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制,因而一种荧光抗体可作更广泛的应用,敏感性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。
 
二、操作指南
 
1、材料
 
(1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers盐水作2倍稀释成1:2,1:4,1:8……。补体用1:10稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价,如为1:32则免疫血清应作1:8稀释。
 
(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中,溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
 
(3)抗补体荧光抗体:在免疫血清效价为1:4,补体为2单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
 
2、操作步骤
 
(1)涂片或切片固定。
 
(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内。
 
(3)用缓冲盐水洗2次,搅拌,每次5min,吸干标本周围水液。
 
(4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min,37℃,水洗同(3)。
 
(5)蒸馏水洗1min,缓冲甘油封固。
 
3.对照染色
 
(1)抗原对照。
 
(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。
 
(3)灭活补体对照:将补体经56℃ 30min处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色。
 
编辑:songjiajie2010

 
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