VIP标识 上网做生意,首选VIP会员| 设为首页| 加入桌面| | 手机版| 无图版| RSS订阅
 

培养基的制备、使用、保存及相关疑难解答

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-06-28  浏览次数:227
核心提示:01培养基的实验室制备确制备培养基时微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分,尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选
 

01

培养基的实验室制备



确制备培养基时微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分,尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时,应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题。


使用商品化脱水合成培养基制备培养基时,应严格按照厂商提供的使用说明配置。记录所有相关数据,如质量/体积、pH、制备日期、灭菌条件和制备人员等。


使用各别成分制备培养基时,应按照配方准确配制,记录所有细节信息,如;培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等,以便潮源。

 


1.水


除特定要求,实验室用水的电导率在25℃下应不高于25uS/cm(相当于电阻率≥0.4MΩcm)。

微生物污染应不超过
103CFU/mL,最好低于102CFU/mL。应根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期检验微生物的污染。

 


2.称量和复水


称量所需量的脱水培养基(注意防止吸入粉末,尤其是含有有害物质的培养基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培养基结块)后再加水至所需的量。

 


3.溶解和分装


脱水培养基加水后适当加热,并不搅拌使其快速溶解,必要时,重新溶解。含琼脂的培养基在加热溶解前应浸泡几分钟。

 


4.pH的测定和调整


用pH计测定pH,必要时在灭菌前调节pH,除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25℃时,要求pH的变化不超过0.2pH单位.通常使用浓度约为40g/L( 约1 mol/ L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L(约1mol/L)的盐酸溶液调节pH。如果灭菌后调节pH,溶液需灭菌。


注:商品化培养基在高压灭菌前后pH可能发生明显变化,但使用蒸馏水或去离子水时,灭菌前无需调节pH。

 


5.分装


将配置好的培养基分装到适当的容器中,容器的体积至少为体积的1.2倍。

 


6.灭菌


①概述

培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。

有些培养基无需高压灭菌,可煮灭菌。如,含亮绿的肠道菌培养基对光和热特别敏感,应在煮沸后快速冷却,避光保存。同样,一些试剂则不需要灭菌,直接使用(参见相关标准或生产厂商的使用说明)。

 


②湿热灭菌

湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行。高压霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培养基的体积超过1000mL,要对灭菌条件进行适当的调整。所有操作均要按照标准和使用说明的规定进行。


注:大容量培养基(>1000mL)灭菌时可能会造成过度加热。

加热后应采取适当的方式冷却,防止沸溢。这对大容量培养基和敏感性培养基(如含亮绿的培养基)是非常重要的。


③过滤灭菌


过滤灭菌可以在真空负压或正压条件下进行。使用无菌设备和0.2um孔径的滤膜。将过滤装置的各个部分消毒灭菌,或使用预消毒设备。


一些滤膜上附着蛋白质或其他物质(如抗生素)。为达到有效过滤,应事先将滤膜用无菌水润湿。


④监测


应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。

 


7.添加剂的制备


制备含有有毒物质(特别是抗生素)时应小心操作,避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。采用适当的预防措施并小心按照产品使用说明操作。不要使用过期的试剂;抗生素工作溶液现配现用;批量配置的抗生素溶液分装后向冷冻保存,但解冻后的贮存溶液不可再次冷冻;厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的相关资料,也可由使用者自行测定。

 

02

培养基的使用


1.琼脂培养基的融化


将培养基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高压锅中的蒸汽)融化。经过高压灭菌的培养基尽量减少重新加热的时间,避免过度加热。培养基融化后立即移开,室温静置片刻(约2min),以免玻璃容器发生破裂。


融化后的培养基放入47℃~50℃恒温水浴锅中保温,冷却到47℃~50℃所需的时间取决于培养基的类型、体积和在水锅里的分装量。融化后内培养基应尽快使用,放置时间一般不超过4h。剩余的培养基固后不得再次融化使用。特别是灵敏性培养基,应根据相关标准,缩短融化后放置的时间。


将琼脂培养基倒入类似检测培养使用的独立容器中,插入温度计,记录并保存琼脂的融化温度。


加入样品的培养基应将温度调节到44℃~47℃,或按照相关标准调节温度。

 


2.培养基的脱气


必要时,在使用前将养基放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min,加热时松开容器盖子;加热后盖紧盖子,并迅速冷却至使用温度。

 


3.添加成分的加入


对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃~50℃时加入,灭菌的添加成分加入前应冷却至室温,避免冷的液体会造成琼脂凝胶或形成片状物。将添加成分慢加入培养基并充分混匀,尽快分装到待用的容器中。

 


4.培养基的弃置


所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式,并符合相关法律法规的规定。

 

 

03

 

平板的制备和储存

 


傾注融化后的培养基到平皿中,使之在乎皿中形成一个至少3mm厚度的琼脂层(直经90mm的平皿通常要加入18mL-20mL琼脂培养基),或根据相关标准要求制备平皿。将平皿盖好皿盖后放置在水平平面使指冷却凝固。如果平板要储存、培养时间超过48h或培养温度超过40℃,要增加培养基的倾注量。


注:在培养过程中,琼脂培养基会损失水分,在某些环境条件下会影响微生物的生长。,造成培养基水分损失的因素很多,如培养基的成分、平皿中培养基的量、培养箱的类型(如使用带风扇的培养箱)、培养箱里的空气湿度、平皿在培养箱中放置的位置和数量以及培养温度等。


凝固后的培养基应立即使用或存放在防止其成分发生变化的条件下,如存放于暗处和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或侧面做好标记,标记的内容包括培养基名称、制备日期和(或)有效期,也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。


将倾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生,平板应冷却后再装入密封袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。


对于采用表面接种的固体培养基,应先对琼脂表面进行干燥:揭开平皿盖,将平板倒扣于烘箱/培养箱中(温度设置为25℃~50℃);或放在有对流风的无菌净化台中,直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商业化的平板脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

 

 

04

疑难解答


1.培养基不能凝固  
                                            


①培养基制备过程中过度加热


②低pH值造成培养基酸解


③琼脂使用量不正确                                           


④琼脂未完全溶解                                             


⑤培养基成分未充分混匀  
                                                                                               


2.pH值不正确  
                                                 


①培养基制备过程中过度加热


②水质不佳                                                 


③外部化学物质污染


④在不正确温度下测量pH值


⑤pH计未正确校准                                           


⑥脱水培养基质量差   
                                                                                                     


3.颜色异常        
                                                


①培养基制备过程中过度加热


②水质不佳                                               


③脱水培养基质量差                                          


④pH值不正确                                                   


⑤外来污染     
                                                                                                         


4.产生沉淀  
                                                    


①培养基制备过程中过度加热


②水质不佳                                                 


③脱水培养基质量差


④pH值未正确控制


⑤如果是各别成分制备的培养基---原材料不纯                                                                   
                   


5.培养基出现抑制/生长率低


①培养基制备过程中过度加热


②水质不佳                                                


③脱水培养基质量差                                         


④配方使用不对                                                   


⑤添加成分不正确,如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误       


⑥添加物被污染                                                                    
                


6.污染   
                                                  


①灭菌不充分                                               


②无菌操作有误                                                   


③添加物被污染
         


编辑:songjiajie2010

 
[ 网刊订阅 ]  [ 检验技术搜索 ]  [ ]  [ 告诉好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 关闭窗口 ] [ 返回顶部 ]
 
0条 [查看全部]  相关评论

 
 
推荐图文
推荐检验技术
点击排行
检验技术