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PCR检测的那点事儿(二)

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-04-20  来源:食品微生物检验公众号  浏览次数:254
核心提示:对于PCR检测来说,必须有配套的实验室来进行操作,规范的实验室是实验成功的基础,那么PCR实验室如何装修设计?PCR实验室又有哪些
 对于PCR检测来说,必须有配套的实验室来进行操作,规范的实验室是实验成功的基础,那么PCR实验室如何装修设计?PCR实验室又有哪些管理要点呢?今天小编就为大家分享这方面的知识。快来看看你的实验室布局是否合理吧!

一、PCR实验室装修知识


这里着重介绍PCR实验室装修的功能区划分,建议从3方面来考虑,即:普通实验区、污染控制区、气流组织。

 

1.普通实验区

 

包括产物分析区、扩增区、样品制备区、试剂准备区这4个区域。

 

2.污染控制区

 

此区域的规划有3套方案,第1套为各功能间相互串通,以套间方式进入人流/物流;第2套为设置独立缓冲间,人流/物流分道,流程相邻间设置物流传递窗;第3套为设置共用缓冲间/缓冲走廊。

 

3.气流组织

 

各个区域之间应具备单相的实验工艺流、物流、人流和气流,形成单向流程的保护屏障,避免实验之间的相互干扰,防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。PCR实验室并没有严格的净化要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证个实验区的压力要求。 

PCR实验室装修的气流组织需要从原始试剂混配室、DNA提取室、PCR扩增室、检测室、送风口这5方面来考虑。

①原始试剂混配室:房间压差为正压,配备有洁净工作台,以防止其他功能间对本房间的污染。

②DNA提取室:房间压差为负压,配备有排风系统,以防止提取核酸产生的气溶胶对工作人员的伤害及扩散污染。

③PCR扩增室:房间压差为负压,与DNA提取室一样,配备有排风系统,以防止扩增产物造成的扩散污染。

④检测室:房间压差为负压,与DNA提取室、PCR扩增室一样,配备有排风系统,以防止相关污染。

⑤送风口:采用的是顶送风,侧下回/排风方式。


二、PCR实验室设计知识


这里着重介绍PCR走廊、传递窗这2方面的最新知识。

 

1、PCR走廊

 

PCR走廊并不是标配,进深不够时不要做PCR走廊,且PCR走廊会增加交叉污染。

Tips:这4个分区(试剂储存和准备区、标本制备区、核算扩增区、产物分析区)原本就不需连接在一起,且在物理空间上必须是完全相互独立的,各区域无论在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通。

 

2、传递窗

 

并非必须设置(只要不涉及洁/污分流就不需要设置传递窗),但一般实验机构/实验人员喜欢设置。

Tips:传递窗的本质—同缓冲间,是物流的缓冲间。在PCR实验室设计中,试剂准备和标本制备间是重点保护的区域,此处最好不要加传递窗,防止交叉污染。实验中的污染风险主要来自于核酸扩增时的加样行为,但由于操作在生物安全柜(起超净台的作用,最新做法)内进行,且确保空气不外溢,因此不存在污染。


三、PCR实验室的管理要点:


 

 

1、样品制备区

这个区域专门用作样品的制备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施;

未设缓冲间时工作区域为负压或减压,可安装排风系统。所有的器具在使用前应经过彻底清洗并消毒,防止交叉污染。主要设备有冰箱、生物安全柜(或洁净工作台、排风柜)、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴、上下水装置、废弃物容器、紫外灯。根据制备样品的性质和要求决定操作台是选用生物安全柜、洁净工作台还是排毒柜,如疾病控制中心、临床医学实验室一般选用生物安全柜,植物转基因、检疫等可选用排毒柜样品制备需要较高洁净条件的选用洁净工作台。

1)PCR产物和带有要扩增序列的产物DNA克隆不能在这个房间操作。

2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。

3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。

4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。

5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。

6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。

7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。

 

2、样品准备和RNA-PCR

RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

 

3、前PCR区

必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

 

 

4、PCR实验室试剂的操作

未设缓冲间的试剂储存和准备区,工作区域为正压。用于扩增的试剂应冰冻储存。主要设备有天平、冰箱、离心机、加样器、振荡器、紫外灯。

1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。

3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入贮存的试剂0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。

4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。

5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。

6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。

7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

 

 

5、在前PCR区建立PCR混合物

1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。

2)如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。

3)作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。

4)阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。

5)当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。

6)由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。

 

6、后PCR区

PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。

 

编辑:songjiajie2010

 
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