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出厂检验常见微生物指标检验方法
在我国的32大类食品生产许可中大都有菌落总数和大肠菌群的出厂检验的规定，菌落总数和大肠菌群作为食品中安全指标，也是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度关注。
今天，小编就带大家一起来详细的了解下食品中菌落总数和大肠菌群检测方法。
菌落总数
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。
菌落总数的测定
1
检验标准:
GB 4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
菌落总数:
食品检样经过处理，在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后，所得每g检样中形成的微生物菌落总数。
制备1:10样品匀液
称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水水的无菌均质杯内8000 rimin- 10000r/min均质1 min-2 min.或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中。用拍击式均质器拍打1min~2 min。制成1:10的样品匀液。
制备1:100样品匀液
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL沿管壁慢慢注入盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头不要触及稀释液面) ，振摇试管或换用支无菌吸管反复吹打使其混合均匀。制成1:100的样品匀液。
制备10倍品匀液
按上一步操作程序。制务10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
取样并制备平板
选择2个一3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液) ，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个释释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内空白对照。
及时将15mL-20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃士1℃恒温水浴锅中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃士1℃培养48 h+2h。
2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，按2.1条件进行培养。
3.1 应对平皿上所有肉眼可见的菌落进行计数
3.2 平板上菌落计数可使用自动化菌落计数仪,也可用肉眼观察(必要时可用放大镜观察)记录培养基上菌落数量和相应的稀释倍数。
3.3 选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
3.4 如果在一个稀释度的两个平板中,一个平板的菌落数在30-300之间,另一个大于300或小于30时,则以30-30之间平板菌落数作为本稀释度结果记录。
3.5 如所有平板的菌落数均在30CFU以下,则记录平板中具体的菌落数;如果没有菌落生长,则记录为小于1CFU。
3.6 如平板上菌落数大于300CFU,则记录为多不可计;但如果所有稀释度的平板上落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数、其他稀释度平板记录为多不可计。
3.7 同一稀释度的两个平行平板中,一个平板有较大片状落生长时、应不进行计数，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。
3.8 如果同一稀释度的两个平行平板均有片状菌落生长,选取片状菌落不到平板一半，而剩余一半落分布均匀的平板,计数一半平板落数并乘以2代表全皿菌落数。
3.9 当平板上出现菌落同无明显界线的状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在30-300CFU之间,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
4.2 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.3 若所有稀释度的平板菌落数均大于300CFU,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.4 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
4.5 若所有稀释度的平板菌落数均不在30-30CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.6 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,除30-300FU范围之外的平板,按如下公式计算:
5.1 菌落计数以落形成单位(colony-forming units，CFU)表示,称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以 CFU/ml为单位报告,表面取样以 CFU/cm2为单位报告。
5.2 菌落数小于100CFU时，按”四舍五入”原则修约，以整数报告。
5.3 菌落数大于或等于100CFU时,将第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数,也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
5.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落延。
5.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
注：菌落总数结果计算与报告方式实例见表2.1
大肠菌群
主要来源于人畜粪便，是以粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
01
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
02
大肠菌群的测定
GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 MPN法
固体和半固体样品:
·称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯 内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
液体样品:
·以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
·用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲 液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
·根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料 LST肉汤),36 ℃± 1 ℃ 培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未 产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中, 36 ℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
按3确证的大肠菌群 BGLB阳性管数,检索 MPN 表(见附录 B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
·制备1:10样品匀液
以无菌操作将检样25g(mL)放于含有225mI.灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1 : 10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000 r/min~10 000 r/min的速度处理1 min,做成1 : 10的均匀稀释液。
·制备1:100样品匀液
用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL,注入盛有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管中，振摇试管混合均匀，制成1:100的样品匀液。
·制备10倍品匀液
领取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
·移取样品
根据食品卫生标准要求或对样品污染情况的估计,选择三个稀释度，每个稀释度接种三。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lmL及以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36 ℃± 1 ℃培养24 h±2 h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36 ℃± 1 ℃温箱内，培养18h~ 24h,然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
伊红美蓝琼脂:伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长.伊红Y为酸性染料，美蓝为碱性染料，琼脂是凝固剂。大肠菌群发酵乳糖产酸时，细菌带正电荷，所以染上伊红(红色)，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，大部分有金属光泽。
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1- 2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36 ℃± 1 ℃培养24 h±2h,观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL (g)大肠菌群的MPN值。
