一、水煮模板法——主要用于PCR反应

1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养18－24小时.

2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟.

3、12000转/分钟离心10分钟,取上清,－20摄氏度保存备用.

    操作最简便,对试剂条件要求低.缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质.但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了.

    有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段.

    编者建议:此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次.

 

二、CTAB/NaCl 法

1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,

2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;

3、5000r/min离心10分钟,弃去上清.

4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用.

5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时

6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟.

7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清.

8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清.

9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀.

10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存.

    CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20μg/ml     RnaseA加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染.每一步操作细致一些,得到的DNA可用于Southern blot.

    编者建议:长时间保存DNA可放于-20℃,但要尽量减少反复冻融,否则影响DNA质量.

三、盐析法

1、1.5ml对数期菌液

2、12000rpm 30 s

3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法）,37c,1hr

4、66ul 5M NaCL,混匀充分,12000rpm 10min

5、上清用粗枪头取至新管

6、等体积酚充分混匀,12000rpm 3min,反复抽提至无蛋白层

7、取水层,等体积氯仿混匀,12000rpm 3min

8、上清至新管,2倍体积预冷无水乙醇

9、-20C,20min,14000rpm, 15min

10、400ul 70%冷乙醇洗涤

11、干燥,100ul 20ug/ml RNaseA,37C,30min

12、2倍体积无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗涤

13、干燥,溶于100ul TE

    介于方法一和方法二之间,CTAB虽然取出糖分效果较好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放弃了CTAB.

    革兰氏阳性菌,由于细胞壁的结构与阴性菌有差别,裂解比阴性菌稍微麻烦一些,可以采取CTAB/NaCl法稍加修改,在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶,37度温育1h.

实验注意:提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下,使其断口圆滑）.以免枪头损伤基因组!抽干时最好是风干!

    较精细的实验,如Southern,强烈推荐用试剂盒!