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乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-08-29  来源:食品科学杂志  浏览次数:63
核心提示:嗜酸乳杆菌是重要的益生菌,被大量应用在食品中。研究表明嗜酸乳杆菌能在乳制品中产生乳酸,并能通过氨基酸代谢增加风味。嗜酸乳
嗜酸乳杆菌是重要的益生菌,被大量应用在食品中。研究表明嗜酸乳杆菌能在乳制品中产生乳酸,并能通过氨基酸代谢增加风味。嗜酸乳杆菌主要作用有降低pH值、产生抗菌素(如嗜酸菌素和乳酸杀菌素等),在一定程度上抑制肠道中有害微生物的有害作用。有研究发现嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、腹泻致病菌等均有抑制作用;大量的嗜酸乳杆菌还可阻碍胆固醇的合成,降低血浆中胆固醇含量;另外对于乳糖不耐症也有一定的疗效。嗜酸乳杆菌对肠道菌群的平衡和对微生态的调节也证明其对健康具有促进的作用。


目前在DNA水平上的分子检测方法越来越多,其检测方法快速方便、灵敏、省时被广泛应用到物种检测中。其中实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术因其高特异性、高灵敏度、无污染等优点,在食品检测中备受青睐。上海市质量监督检验技术研究院,国家食品质量监督检验中心(上海)的张娜娜、刘 洋*、俞 漪等人建立基于嗜酸乳杆菌SPIDR保守区域的序列结合实时荧光定量PCR方法定量检测饮料中的嗜酸乳杆菌,以保障食品安全监管顺利进行。



1.实时荧光定量PCR方法的特异性

所有嗜酸乳杆菌的标准菌株均有明显扩增,且Ct值在16~18之间,其他菌株均无明显的扩增;采用乳杆菌通用引物对所有菌株进行扩增时,可见到清晰的扩增条目。证明本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法对于嗜酸乳杆菌有较好的特异性。

2.检测方法的灵敏度

①实时荧光定量PCR方法的绝对灵敏度

嗜酸乳杆菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可稳定检测的最低质量浓度为0.00058ng/μL。每个模板添加4μL,即检测限在3pg左右,本研究的实时荧光定量PCR体系的绝对灵敏度达到3pg。


②实时荧光定量PCR的相对灵敏度

嗜酸乳杆菌ATCC4356的绝对灵敏度可稳定检出的最低浓度为103 CFU/mL。根据绝对灵敏度和相对灵敏度的检测可得出实时荧光定量PCR的检测限为103CFU/mL。

3.实时荧光定量PCR方法的重复性检测结果

 

嗜酸乳杆菌ATCC4356不同的核酸浓度扩增,每个质量浓度6个平行,最终实验结果Ct值的SD介于0.14~0.56之间,RSD介于0.862%~2.55%之间,均在可接受范围内。证明建立的实时荧光定量PCR方法重复性较好。



4.实时荧光定量PCR方法的抗干扰能力

在样品中混入103106CFU/mL的杂菌对实时荧光定量PCR的扩增是没有干扰的,且检出限仍为103CFU/mL;在不同浓度的嗜酸乳杆菌ATCC4356的核酸中添加300pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大肠杆菌ATCC25922的核酸提取物,各浓度梯度核酸检出的Ct值均未受影响,证明建立的实时荧光定量PCR扩增体系抗干扰能力强。

5.模拟样品的检测及标准曲

 

为验证建立的方法是否可以在实际样品中进行检测,在进行实样检测之前,利用模拟样品对该方法进行验证。这样不仅可以节约时间,且节省成本在不含嗜酸乳杆菌的乳酸菌饮料为基质的模拟样品检测中,以Ct值为纵坐标,以嗜酸乳杆菌标准株已知的不同稀释菌数对数Lg(CFU/g)为横坐标建立标准曲线,得出线性方程为y=-3.312 4x+38.939,

R2=0.987,检测结果的线性较好且检测限仍为103CFU/mL。


6.实际样品检测结果

11份样品中,6份样品检测出含有嗜酸乳杆菌,编号分别为B1、B4、B6、B7、B8、B9,这与购买样品的便签信息一致。检测结果可以看出,嗜酸乳杆菌的含量在5.83×102~3.68×104 CFU/mL之间,建立的实时荧光定量PCR方法可以用砸乳酸菌饮料中对嗜酸乳杆菌进行定量。

讨论与结论

本研究利用设计的嗜酸乳杆菌属的特异性引物建立实时荧光定量PCR方法在乳酸菌饮料中的检测应用。结果证明,该方法的特异性好,检测限低,纯基因水平检测限在3pg左右,绝对灵敏度检测达到103CFU/mL,且重复性较好;在纯基因水平与培养物水平的抗干扰能力都很强;模拟样品检测中其检测限未改变,重复性较好,证明适合在市场检测中使用;实际样品检测结果与标签信息一致。并得出嗜酸乳杆菌相应的添加量,只是嗜酸乳杆菌的含量有所不同。这一研究证明该方法可应用在乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的快速检测。

编辑:songjiajie2010

 
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