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前沿科技| 氨甲酰磷酸不同合成途径在大肠杆菌中的比较

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-10-23  浏览次数:91
核心提示:氨甲酰磷酸的合成具有极为重要的意义,本研究以大肠杆菌为材料,建立了细胞水平的氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上,对氨甲酰磷酸
 氨甲酰磷酸的合成具有极为重要的意义,本研究以大肠杆菌为材料,建立了细胞水平的氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上,对氨甲酰磷酸合成的CPS Ⅱ途径与CK途径在全细胞催化水平进行了相应的比较和优化。优化后的CPS Ⅱ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,这为相关高附加值化合物的合成提供了一种更加高效的策略。

1、背景


氨甲酰磷酸是生物合成代谢中精氨酸与嘧啶的重要前体物质,在工业微生物生产精氨酸与嘧啶及其衍生物中发挥关键作用。


2、目的

在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中比较氨甲酰磷酸不同合成途径的催化效率。


3、方法

在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中过表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的基础上,分别过表达大肠杆菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPS Ⅱ)并表征其反应效果。通过优化底物供应(调整底物浓度与引入L-谷氨酰胺合成酶)对CK与CPS Ⅱ的催化反应进行优化。


4、结果

在大肠杆菌中过表达OTC,建立细胞水平氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上比较不同来源的CK,发现大肠杆菌来源的CK效果最好,50 mmol/L NH4HCO3条件下全细胞催化9 h得到2.95±0.15 mmol/L L-瓜氨酸;过表达CPS Ⅱ时,50 mmol/L L-谷氨酰胺催化9 h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通过改变底物NH4HCO3浓度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式对CK与CPS Ⅱ的催化反应分别进行优化后,100 mmol/L NH4HCO3条件下,L-瓜氨酸浓度分别提高至4.67±0.55 mmol/L和6.12±0.38 mmol/L,且过表达GS后CPS Ⅱ途径可以利用NH3,不需要额外添加L-谷氨酰胺。


5、结论

【结论】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPS Ⅱ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,为精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一种更加高效的策略。

图1  氨甲酰磷酸的不同合成途径与L-瓜氨酸合成途径

Figure 1  Different carbamoyl phosphate synthetic pathways and L-citrulline synthetic pathway

 


图2  SDS-PAGE分析不同来源CK的蛋白表达(A)与催化能力比较(B)

Figure 2 SDS-PAGE analysis of expressions of CKs from different species (A) and comparison of catalytic capacity of CKs (B)


图3  SDS-PAGE分析CPS Ⅱ的蛋白表达(A)与催化效果(B)

Figure 3  SDS-PAGE analysis of expression of CPS Ⅱ (A) and catalytic effect (B)

 

 


图4  NH4HCO3浓度对菌株ECFI合成氨甲酰磷酸的影响

Figure 4 Effects of different concentrations of NH4HCO3 on synthesizing carbamoyl phosphate by strain ECFI

图5  引入两岐双岐杆菌来源GS对CPS Ⅱ途径的影响(A),以及降低L-谷氨酰胺添加量对菌株GSABFI的影响(B)

Figure 5 The effect on CPS Ⅱ synthesis with the introduction of GS from Bifidobacterium bifidum (A), and the effect of reducing the amount of L-glutamine on the strain GSABFI (B)

图6  两种合成氨甲酰磷酸途径的比较

Figure 6  Comparison of two carbamoyl phosphate biosynthesis pathways


 


编辑:songjiajie2010

 
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