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氨基酸总量测定

放大字体  缩小字体 发布日期:2005-10-08  浏览次数:11539

蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分,如水解后的产物经胨,肽等最后成为氨基酸,氨基酸是构成pro最基本的物质。

水解后的pro和水解前的pro在物理特性,化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的,其差别与水解的程度有密切关系,分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度,也就可以评价食品的营养价值。

氨基酸不是单纯的一种物质,用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵,不能普遍使用),对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中,所以需要测定总的氨基酸量,它们不能以氨基酸百分率来表示,只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分率表示,当然,如果食品中只含有一种氨基酸,如味精中的谷氨酸,就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。

食品在评价蛋白质的营养价值时,除了测定pro的含量,氨基酸氮含量,还需要对各种氨基酸进行分离,鉴定,尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。

一.单指示剂甲醛滴定法:

1原理:氨基酸具有酸,碱两重性质,因为氨基酸含有-COOH基,而-COOH基显示酸性,又含有-NH2-NH2则显示碱性,由于-COOH基和-NH2的相互作用,使氨基酸成为中性的内盐,当加入甲醛溶液时,-NH2与甲醛结合,其碱性消失,破坏内盐的存在,就可用碱来滴定-COOH基,以间接方法测定氨基酸的量,反应式以三种形式存在。

用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2

2试剂:

140%中性甲醛溶液:以百里酚酞作指示剂,将甲醛用1N NaOH溶液中和(淡兰色)。20.1%百里酚酞乙醇溶液。

30.100N  NaOH标准溶液。

3操作步骤:

称约含20mg左右的氨基酸→于烧杯中(如为固体样加水50ml)→加两滴指示剂→用0.1N NaOH溶液滴定到淡兰色→加中性甲醛20ml→摇匀→静置1分钟→此时兰色应消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡兰色,记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。

计算:氨基酸态氮=N×V×0.014×100/W×100

 

二.双指示剂甲醛滴定法

 

1原理:

 

与单色法相同,只是在此法中使用了两种指示剂,从分析结果看,双指示剂甲醛滴定法与

亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂,但准确,不作介绍)相近,单色滴定法稍偏低,主要

因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点,PH值为7.0,从理论计

算看,双色滴定法比单色滴定法准确。

 

2试剂:同单指示剂一样,多一个0.1%中性红(50%乙醇溶液)

 

3操作步骤:

 

取相同两份样品→分别于100ml三角瓶→一份加中性红2滴→用0.1N  NaOH滴定终点(由红

变琥珀色),记录用量,另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1N 

NaOH 滴至淡兰色。

计算:

氨基酸态氮=N×(V2-V1)×0.014×100/W×100

V1——用中性红为指示剂时,碱液所消耗的体积

V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量

0.014——氮的毫克当量浓度

注意事项:

1)单色指示剂甲醛滴定法,用碱完全中和—COOH基时的pH8.59.5

2)测定样品的颜色较深,应加活性炭脱色之后再滴定

 

三.茚三酮比色法:

 

1原理:氨基酸在一定pH范围内,能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。

 

2试剂:

 

1)磷酸缓冲液(pH.8.04)制备方法如下:

称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml

NAH2PO4·12H2O   11.9380g分别溶解定容500ml

取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液

22%茚三酮溶液:

称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)搅拌过滤(作防腐剂)→

于冷暗处过夜→定容50ml

  氨基酸标液

称干燥氨基酸(如异亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶

定容100ml,即得200Ug/ml标液

 

3操作方法:

1)绘制标准曲线:

725ml容量瓶,吸取标液 0   0.5   1.0   1.5   2.0   2.5   3.0ml725ml容量瓶,加水补充

至容积为4ml,然后加茚三酮和缓冲液各1ml,于水浴加热15分钟,冷却后定容25ml,静置

15分钟,在570nm下测消光值,绘制标准曲线。

2)样品测定:

取样品5.00~10.0g(液体样5-10ml)→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用

3040ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟,

冷却定容,静置15分钟于570nm下测定消光值,按下式计算氨基酸含量。

氨基酸含量(毫克/100克)=C/W×1000)×100

C——从标准曲线上查得得氨基酸的量(Ug

W——测定得样品溶液相当于样品的量(g

注意事项:

茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色,使用前要进行纯

化,方法如下:、

10g茚三酮容于40ml热水中,加一克活性炭,摇匀静置30分钟,过滤,将滤液放入冰箱中

过滤,即出现兰色结晶,过滤,用2ml冷水洗涤结晶,置干燥皿中干燥,装瓶备用。

思考题

1 试述蛋白质测定中,样品消化过程所必须注意的事项,消化过程中内容物颜色发生什么变化?为什么?

2 样品经消化进行蒸馏前,为什么要加入氢氧化钠?这时溶液发生什么变化?为什么?如果没有变化,说明什么问题?须采用什么措施?

3 硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用?
4
试述氨基酸态氮的测定原理。·

5 结果计算中为什么要乘上蛋白质系数?

实验:①水果中酸度的测定。

            ②糕点中和脂肪的测定。

 
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