天然食品及食品原料多数本身具有特有的色泽和香味，人们在长期的生活习惯中也认识了各种食品应有的色泽，食品的色泽已经成为食品的一个重要感官指标。然而，食品在保存及加工过程中，其色泽往往会有不同程度的变化，为了改善食品的色泽，使食品尽可能恢复原来的颜色，除采取一定护色措施外，往往还得添加一定量的食用色素，进行着色。

食用色素就来源可分成两大类：天然色素和合成色素

天然色素的优缺点：

1、优点：

⑴ 其色素是从一些动物、植物组织中提取出来；

⑵ 安全性高；

2、缺点：

⑴ 稳定性差（对光、热、酸、碱等条件敏感）；

⑵ 着色能力差；

⑶ 难以调出任意的色泽；

⑷ 资源短缺，不能满足食品工业的需求；

⑸ 价格昂贵。

合成色素优缺点：

1、优点：

⑴ 资源十分丰富（来自于煤焦油及其副产品）；

⑵ 稳定性好、色泽鲜艳、着色力强、能调出任意颜色；

⑶ 价格低廉；

⑷ 应用广泛；

2、缺点：

⑴ 毒性较大（因为属合成所以毒性大，有的甚至致癌）；

⑵ 食用剂量加以限制。

对合成色素在测定时采用的几大步骤如下：

样品前处理→提纯→分离→鉴别（何种色素）→定量（此色素含量是否超标）

⑴ 前处理方法有：前处理不外乎是将样品打浆或者将着色部分用刀刮下，定容、吸附、解吸等方法处理；

⑵ 提纯的方法

（1） 羊毛染色法：此法应用较广泛，主要是简单，材料容易弄到，操作也方便。缺点为：要在热的酸性条件下吸附色素，用氨溶液解吸色素时，往往色素起变化。当溶液中含量低时（色素含量低），用羊毛染色法吸附色素不完全，回收率低；

（2） 聚酰胺粉法：此法是分离两种以上的色素，是目前比较理想的方法，因为食品中大多数使用拼色。聚酰胺粉在酸性溶液中能与人工合成色素牢固地结合，并能在很稀的溶液中吸附色素，但对天然色素的吸附不紧密，能被甲醇-甲酸洗脱下来；

（3） 离子交换法

（4） 分子筛分离法

⑶ 目前分离方法

（1） 滤纸层析法；（2） 薄层层析法；（3） 柱层析法；（4） 电泳法

⑷ 色素鉴定方法

（1） 采用纸层析法进行定性（与标准样进行对照 Rf）；

（2） 采用薄层层析、比色的方法进行定量。

在食品中添加色素，经常是由两种以上的色素配合而成的拼色，对色素的测定，先处理、提纯，然后把每一种色素要分离开，再对每一种色素的量进行定量。

目前，在食品行业中使用单一色素已经比较少，大多数使用复合色素方可达到比较满意色泽，因而给分析工作者带来一定困难。目前合成色素的测定方法主要有：(1)薄层层析法；(2)高效液相色谱法。

一、薄层层析法（聚酰胺粉法）

1、原理

聚酰胺是具有二极性的化合物，在酸性条件下与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离，然后再在碱性条件下解吸色素，再在薄层层析法进行分离鉴别，与标准比较定性、定量（纸层析进行定性，薄层层析进行定量）。

2、操作步骤

食品其形态是千变万化的，添加在食品中的色素方式亦是各种各样的，有的拼色加入，有的加在食品的表层几个色素点，有的覆盖一层色素, 有的用色素和鸡蛋，很形象地作成传说中的故事、动物、花卉以及象征丰收、延年益寿、节日愉快、生日快乐等附在食品的最显眼的地方，属于这类食品的有中式糕点、西式糕点，还有饮料、小食品等色素的测定。样品不同，处理方法则就不一样。

⑴ 样品表面色素的测定

如中式、西式、生日蛋糕、节日寿糕一类，首先将代表性的样品整体称重，记录重量，然后分别取下相同着色部分，进行提取和分离，不要将部分着色样品和整个或大部分不着色样品混在一起。如果这样，分离就困难，而且增加分离误差，使结果偏差大，例如一块蛋糕重500g，取下色素部分经测定是50mg，表示500g重的含量即万分之一。

⑵ 样品外皮色素的测定

如儿童食品中的糖豆、朱古力豆、红心果等样品，只需将外表皮色素用少量的水溶下来（在用水溶解之前，先称重量并记录），并定容一定体积（将没有色素的样品弃去），供检验用，其计算与上面一样。

⑶ 非酒精性饮料中色素的测定（各种汽水、桔子汁等）

(1) 吸附

吸50ml样→与烧杯中→在电炉上加热至沸→不断搅拌除CO₂→加1g聚酰胺粉（60℃活化1小时）→充分搅拌→使色素完全被聚酰胺粉吸附→用布氏漏斗过滤→用80℃热水20ml洗沉淀物→用甲醇-甲酸（6︰4）20ml再洗沉淀物（除天然色素）→直到滤下来溶液无色→再用80℃热水150ml分次洗沉淀物。

(2) 解吸

在不抽滤条件下，将9︰1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脱下来，收集于蒸发器中，水浴中浓液到5ml左右，加3滴20%柠檬酸溶液（使色素稳定），定容10ml，供薄层点样用。

(3) 注意事项

样品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的柠檬酸调节pH=4（聚酰胺粉末在弱酸性溶液中对色素吸附力强，吸附亦完全）。

如果样品不含天然色素，除CO₂后直接加聚酰胺吸附。

⑷ 对各种糖果色素的测定

1) 样品处理

a.      硬糖（不含蛋白质、淀粉）粉碎→称样3g→加50ml水溶解→再加30%柠檬酸3滴调pH=4

b.     软糖（含淀粉高果饴）除外层冰糖屑→切碎→加50ml热水溶解→用20%柠檬酸调pH=4→加淀粉酶1ml（消化淀粉）→90℃水浴15分钟→溶液中出现沉淀物直到变清

c.     奶糖→加9︰1乙醇氨溶液溶解→用1︰10H₂SO₄调pH→加1%钨酸钠使蛋白质沉淀，奶脂凝集沉淀→布氏漏斗抽滤

2) 吸附色素

1g聚酰胺粉+糖液→70℃水浴→搅拌使之充分吸附→用布氏漏斗抽滤→用80℃水洗漏斗上的沉淀物→再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）→再用80℃水洗沉淀物→洗到pH与原水相同

3) 解吸色素

沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸→收集于蒸发皿中→水浴浓液到4ml→加20%柠檬酸3滴→用水定容10ml→留做点样用（单一色素直接比色，拼色要分离，先定性后定量）

⑸ 肉和肉制品中色素的测定

1) 前处理

称处理样→加海砂3g和20ml丙酮→于研钵中一起研→除去脂肪和水分→除去丙酮

2) 解吸样液中的色素

将上面沉淀物放入布氏漏斗→用解吸液从肉蛋白中使色素全部解吸下来→加热到70℃→用1︰10H₂SO₄调PH再加1ml10%钨酸钠→使蛋白质全部凝聚沉淀→用布氏漏斗抽滤→用70℃水20ml洗漏斗→收集全部滤液

3) 吸附样液中的色素

称1g聚酰胺粉+上面的滤液→搅拌→抽滤→用水洗漏斗中沉淀物→直到滤水与原水PH相同

4) 解吸样液中色素（与非酒精性饮料相同）

⑹ 果脯类色素的测定

1) 处理

取样研碎后称2g→加50ml水→加热70℃使溶解

2) 吸附

吸附剂1g+上述液→抽滤→用70℃热水洗沉淀物

3) 除天然色素

用甲醇-甲酸（6︰4）混合液解吸天然色素→直到滤液无色为止→再加甲醇10ml进一步除天然色素→70℃热水洗，不断搅拌

4) 解吸

用解吸液解吸样品沉淀物中全部人工合成色素→浓液解吸液（甲醇、氨）直到无甲醇、氨时→用1︰10H₂SO₄调pH=4→再按上述加吸附剂操作重复1-2次，把天然色素全部去净为止，最后解吸、定容同上。

⑺ 各种加工蔬菜中色素的测定

这一类色素测定按理论应该以蜜饯的操作来处理，但在实验中这些样品胶体过多，使解吸、过滤等操作非常困难，所以我们应该按下述方法进行：取样20g（干菜2g），加入100ml 80%的乙醇溶液，浸泡2小时，再以含有1%氨水的70%乙醇反复浸出，合并浸出液，直到色素全部被洗脱下来，置70-80℃水浴上，将全部浸出液浓缩，待氨全部逸出去（没有氨味），调pH=4，加1g聚酰胺吸附，然后用布氏漏斗过滤，以200ml 70-80℃水洗涤漏斗的聚酰胺粉，然后用甲醇-甲酸洗脱天然色素。以上操作同蜜饯中色素的测定方法。

⑻ 提纯色素溶液的纸层析定性

为了判断样品中存在有几种色素以及是什么色素，必须进行纸层析进行鉴定。

经浓缩后样品色素溶液→于新华中速层析滤纸上点样→点样量3-5微升（若样品含量低可取出1ml在浓缩至0.2ml再点样）→点样点的直径应不超过2毫米为宜→点样线距底边2厘米→样点间距离以及左右纸边各距2厘米→用展开剂展开→测量各色素点的R_f值→于标准色素R_f值对照→确定何种色素（以标准色素斑点R_f值衡量样品各色素斑点的R_f值是否于标准点在同一条直线上，色素的颜色是否完全一致，就可确定样品色素属于何种色素）。                       

Rf（比移值）=斑点移动距离/溶剂前沿距离                        

所使用的展开剂有：

1)正丁醇︰无水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3

2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4

3)异丁醇︰无水乙醇︰水 = 3︰2︰2

⑼ 提纯色素溶液的薄层分离和定量

经过纸层析定性之后，含有一种色素的样液定容之后，离心即可定量；含有两种以上的复合色素的样品溶液，需要经过薄层分离为单色素后，再用比色法分别定量，测定出各种色素的含量。

具体步骤是：薄层板制板→点样层析→比色→标准曲线绘制→计算含量

1) 薄层板制备

聚酰胺粉1g于研钵中→加15ml 75%甲酸→搅拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅胶G→研磨1分钟→立即涂板（玻璃板要求光滑平整，先用水洗净，干燥后用酒精擦拭干净，涂板时可用涂本器或手工玻璃涂布）→可涂15×10厘米玻璃板三块（厚度为0.25-0.3毫米）→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→盖好盖子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小时→取出玻璃板→于空气中风干→于60-65℃烘箱30分钟→放入干燥器中备用

2) 点样层析

用点样管（毛细管、微量注射器）将浓缩并定容的样液点在薄层板上→基线距底边2厘米→点成与底边平行的条状→两端距边各为2厘米，点样量一般为0.4ml→点样时要用电吹风机边点边吹干→然后进行展层析

展层缸先用溶剂系流30分钟→再把点好样的薄层板放入展析缸用上行法展开→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大约1小时看色素已明显分开后→即可取出薄板→晾干

对溶剂系流的选择是：a) 分离胭脂红、苋菜红、新红、柠檬黄、桔黄、靛蓝等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4（这种展开剂主要分离靛蓝，因为靛蓝上升很快，其它上升很慢）；b) 分离柠檬黄、胭脂红、苋菜红、柠檬黄、桔黄等时用展开剂为2.5%柠檬酸钠︰氨水=4︰3（柠檬黄上升很快，其它上升慢）；c) 对于分离两种红色素（苋菜红、胭脂红）的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水=10︰3︰4（主要是苋菜红与胭脂红上升快，其它色素上升慢）。

3) 比色定量

将薄层板展开后→用小刀分别将各条色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽滤→于水浴上蒸发到无氨味→定容10ml→分别测出消光值E（根据各种色素的最大吸收波长测定其光密度）→从标准曲线上查出相应的各色素含量.

4) 标准曲线的制备

先配成标准色素贮备液（100微克/ml），称0.1g标准色素加水稀释至1000ml

10ml比色管 0   1     2     3     4    5     6     7    8    9

标准应用液 0  0.1  0.5  1.0  2.0  3.0  4.0  5.0  6.0 7.0

加水                     分别加水至10ml

相当于μg/ml 0  1    5    10   20   30   40   50   60   70

分别测出E_O-E₉的消光值以水为参比，以色素浓度为横生标，消光值为纵坐标，绘制标准曲线。以水为参比，pH值为6，各色素的最大吸收波长为下：

胭脂红 508纳米；柠檬黄 428纳米；苋菜红 520纳米；

晚霞黄 485纳米；赤藓红 528纳米；靛蓝  610纳米；

注意事项

1） 上述两个公式若乘以1/100，即由mg/㎏变为几/万。例如胭脂红含量为80mg/㎏即0.8/万；2） 聚酰胺粉吸附要求预先活化，并要求在一定的温度、pH和一定的作用时间下进行，操作时要注意。聚酰胺在酸性条件下吸附色素牢固，用水洗涤聚酰胺粉以除去可溶性物质，要求水偏酸性（pH=4），防止聚酰胺上色素在洗涤过程中脱落下来；

3）样品的前处理和提纯过程很重要，要充分去除杂质（油脂、蛋白质、淀粉、糖）以免影响吸附及层析效果。

一般能溶解在水中的物质，如食盐、糖、味精、香精等，在用酸性水洗涤聚酰胺粉时都能除去，还有明胶、果胶也可以通过大量水除去；对油脂类可以用丙酮或石油醚洗涤脱脂，如果油脂含量很高，可在研钵中用丙酮、海砂研磨除去；对于样品中蛋白质、淀粉含量高时，可用蛋白酶或钨酸钠、淀粉酶水解后除去；对于天然色素可用6︰4甲醇-甲酸除去；

4） 纸层析定性时不可皱折，边缘应剪齐，不可有毛边，而且要注意纸的横、竖向，应顺纹上行，展开较好，否则结果不规律；

5） 在浓缩样液时应控制水浴温度70-80℃，应使缓慢蒸发，勿溅出皿外，防止色素干结在蒸发皿的壁上（应经常摇动蒸发皿）；

6） 靛蓝褪色由深兰色→浅兰色→黄色→无色。靛蓝褪色是由于光、氧、温度高、PH等多种因素的影响，测定靛蓝时要注意上述因素的影响；

7） 展开剂使用时最好2天换一次，以保证分离效果，放置时间过长造成浓度和极性都起变化，影响分离效果；

8）漏斗用完后要洗净，先用浓HCl20ml少量多次洗，然后用水多次冲洗，否则影响下一个样品的吸附或解吸作用；

9） 聚酰胺粉可回收使用。使用过的聚酰胺收集于干净的烧杯中，用0.5%NaOH溶液浸泡24小时之后水泵抽干，倒回烧杯，加0.1N HCl泡30分钟，然后再用水泵抽干，用水洗至中性，置60℃烘箱烘干备用；

10） 比色时样液要求清晰，若混浊使E增大，影响结果，如果混浊可离心也可放置。