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一、目的与要求：
1、掌握2．6-二氯酚靛酚测定维生毒C的原理和方法。
二、原理：
还原型抗坏血酸能还原染料2.6-二氯酚靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2.6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。
反应式如下：
还原型抗坏血酸染料(粉红色)脱氢型抗坏血酸染料(无色)
三、试剂：
(1)2％草酸溶液：溶解20克草酸结晶于200毫升水中，然后稀释至1000ml。
(2)1％草酸溶液：取上述2％草酸溶液500ml，用水稀释至1000m1。
(3)抗坏血酸标准溶液：准确称取20mg抗坏血酸，溶于1％草酸溶液中，移入lOml量瓶中，并用1％草酸溶液稀释至100毫升，混匀，置冰箱中保存。
使用时吸取上述抗坏血酸5ml，置于50毫升容量瓶中，用1％草酸溶液定容之。此标准使用液每毫升含0.02mg维生素C。
标定：吸取标准使用液5m1于三角烧瓶中，加入6％碘化钾溶液0.5ml，1％淀粉溶液3滴，再以0.001N碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。
计算如下：
抗坏血酸浓度（mg/ml）=( V1×0.088)/V2
V1：滴定时所耗0.001N碘酸钾标准溶液的量(ml)
V2：所取抗坏血酸的量(ml)
0.088：lml O.0001N碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量(mg／m1)
(4)2.6：二氯靛酚溶液：称取碳酸氢钠52mg，溶于200ml沸水中，然后称取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氢钠的溶液中，待冷，置于冰箱中过夜，次日过滤置于250ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。此液应贮于棕色瓶中并冷藏，每星期至少标定1次。
标定方法：取5m1已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1％草酸溶液5ml，摇匀，用上述配制的染料溶液滴定至溶液呈粉红色于15秒不褪色为止
每毫升染料溶液相当于Vc的毫克数=滴定度(T)=(C×V1)/V2
式中：
C；抗坏血酸(V)的浓度(mg／m1)
Vl：抗坏血酸的量(m1)
V2：消耗染料溶液量(m1)
(5)0.1N碘酸钾溶液：精确取干燥的碘酸钾0.100ml。0.3567克用水稀释至100ml.
(6)0.001N碘酸钾溶液：吸取0.1N碘酸钾溶液1ml，用水稀释至100毫升。此溶液1ml相当于抗坏血酸0.088mg。
(7)1％淀粉溶液。
(8)6％碘化钾溶液。
四、操作方法：
1、称取适量(50.0-100.0克)样品，加等量的2％草酸溶液，倒入组织捣碎机中捣成匀浆。称取10.00-30.00克浆状样品(使其含有抗坏血酸1-5mg)，置于小烧杯中，用1％草酸溶液将样品移入100毫升容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。
2、将样液过滤，弃去最初毫升滤液。若样液具有颜色，用白陶土(应选择脱色力强但对抗坏血酸无损失的白陶土)去色，然后迅速吸取5-lOml滤液，置于50ml三角烧瓶中，用标定的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉红色于15秒内不褪色为止。
计算：
每百克样品中抗坏血酸毫克数＝(V .T)/W×100
V：滴定时所耗去染料溶液的量(ml)；
T：lml染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量(mg)
W：滴定时所取的滤液中含样品量(g)．
五、说明：
(1)所有试剂配制最好用重蒸馏水。
(2)样品取样后，应浸泡在已知量2％草酸溶液中使抗坏血酸受损失。以免发生氧化，使抗坏血酸受损失。
(3)对动性的样品可用10％三氯醋酸代替2％草酸溶液提取；对含有大量Fe的样品，如储藏过久的罐头食品可用8％醋酸溶液代替草酸溶液提取。
(4)整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。
(5)若样品滤液无色，可不加色陶土。须加白陶土的，要对每批新的白陶土测定回收率。加白陶土脱色过滤后，样品要迅速滴定。
(6)滴定开始时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失而后尽可能一滴一滴地加入，并要不断振动三角烧瓶，直至呈粉红色于15秒内不消失为止。样品中可能有其他杂质也能还原2.6-二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢，所以滴定时以15秒钟红色不褪为终点。
(7)测定样品溶液时必须同时作一空白对照，样品溶液滴定的毫升数须扣除空白液滴定的毫升数。
实验法(二) 2.4-二硝基苯肼法
一、原理：
用酸处理过的活性炭把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸再继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2.4-二硝基苯肼偶联生成红色的络合物。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。
二、试剂：
(1) 1％草酸溶液。
(2) 2％草酸溶液。
(3) 酸处理过的活性炭：取200克活性炭，加入10％盐酸1000ml，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000ml煮沸，过滤，重复用水洗至滤液中无高价铁离子(即用1％硫氰化钾溶液试验不呈红色为止)，于100-120℃烘干。
(4) 2％2.4-二硝基苯肼溶液：取2克2.4-二硝基苯肼溶液溶解于lOOml9N硫酸中。
(5) 9N硫酸溶液：量取浓硫酸250ml，慢慢地倒入750m1水中，加水边搅拌。
(6) 10％硫酸溶液：称取5克硫酸，溶解于50ml50％酒精中。
(7) 85％硫酸溶液：精确称取20mg抗坏血酸，溶解在1％草酸中，溶液稀释至lOOml。吸取此液50ml，加入0.1克活性炭，振摇1分钟，过滤吸取上述滤液5ml，用1％草酸稀释到100毫升(此标准使用液每亳升含lOug抗坏血酸)。
三、操作方法：
(1)样品的处理和分析：称取适量样品加等量的2％草酸溶液于组织捣碎机中打成匀浆。取匀浆20克用1％草酸稀释至lOOml，摇匀，过滤。
取滤液lOml，加入1％草酸10ml(取滤液的量视抗坏血酸含量而定，一般控制每毫升抗坏血酸的浓度为1-lOug)，加l勺活性炭，摇1分钟，静置过滤。
各取滤液2毫升于样品管和样品空白管中，各管加1滴硫酸溶液。于样品管中加入2.4-二硝基苯肼0.5ml，样品管，样品空白管加盖，置于37℃保温箱中保温3小时。后取出样品管放人冰水中，样品管和样品空白管置于冰浴中，从滴点管中滴加85％硫酸2ml于各管中，边滴边摇试管(为防止溶液温度升高，溶液中糖炭化而转黑色)。
将各管于冰浴中取出，在室温下放置30分钟后，立即在分光光度计波长540nm处读取光密度。根据测得的光密度，从标准曲线中查出相应的含量。
(2) 标准曲线的绘制：分别吸取抗坏血酸标准工作液10、20、30、40、50ml，稀释至50ml，这些标准液每毫升含有2、4、6、8、lOug抗坏血酸。
各取2ml，置于各标准管中，加硫酸溶液1滴和2．4-二硝基苯肼溶液0.5ml，置各管于30℃保温箱中保温3—4小时，取出，放在冰浴中，于各管中滴加85％硫酸2.5ml边滴边摇试管，然后取出，放置30分钟，于分光光度计540nm波长条件下测定光密度。根据测得的光密度绘制标准曲线。
同时作一试剂空白，于一试剂空白管中加入1％草酸溶液2m1，操作同标准管。
计算：每百克食品中含抗坏血酸的毫克数＝C/W×100
C：相当于标准溶液的量(mg)
W：测定时所取得样品溶液相当于样品的量(g)
四、说明：
(1) 加入85％硫酸后，将试管从水中取出。溶液的颜色会继续变深所以必须计算好，加入硫酸后准于30分钟内比色。
(2)硫酸可防止抗坏血酸被氧化，且可帮助准于的形成，最终溶液中硫酸的浓度均需一致，否则影响色度。
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