第2节 微生物的基因突变
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在微生物中，突变是经常发生的，学习和掌握突变的规律，不但有助于对基因定位和基因功能等基本理论问题的了解，而且还为微生物选种、育种提供必要的理论基础,同时对于致癌物质的检测也有重要意义。
突变是指遗传物质突然发生稳定的可遗传的变化，它有两个意义：一是指与野生型不同的个体所携带和传递的基因组变异结构，这种变异结构可以是基因水平的，也可以是染色体水平的；突变的另一个意义是指上述变异结构发生的过程。对微生物来讲，基因突变最常见，最重要，而由于重组或附加体等外源遗传物质的整合而引起DNA的改变，则不属突变的范围。
在微生物纯种群体或混合群体中，都可能偶尔出现个别微生物在形态、生理生化或其他方面的性状发生改变。改变了的性状可以遗传，这时的微生物发生变异，成了变种或变株。
2.1. 突变的类型
突变的类型是多种多样，从突变涉及的范围，可以把突变分为基因突变和染色体畸变。在粗糙脉孢菌中，染色体畸变的研究已经相当深入了。在电子显微镜下现在已经可以观察病毒的染色体畸变。不过就遗传学研究较为深人的大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌等细菌以及其它多数微生物来讲，突变的研究主要是在基因突变方面。下面就分类的依据不同，探讨一下突变的类型。
2.1.1. 从突变涉及范围，可以把突变分为基因突变和染色体畸变。
基因突变，又称点突变。是发生于一个基因座位内部的遗传物质结构变异。往往只涉及一对碱基或少数几个碱基对。点突变可以是碱基对的替代，也可以是碱基对的增减。前者可分为转换和颠换（图5－8）。转换是指一种嘌呤—嘧啶对变为另一种嘌呤—嘧啶对，或一种嘧啶—嘌呤对变为另一种嘧啶—嘌呤对；颠换是指一种嘧啶—嘌呤对变为另一种嘌呤—嘧啶对，或反过来一种嘌呤—嘧啶对变为另一种嘧啶—嘌呤对。这两种碱基的替代突变改变了遗传密码的结构和该密码所编码的氨基酸。碱基对的增减则造成增减变异点以后全部密码及其编码的氨基酸，所以称为移码突变。
图5－8. 各种类型的转换和颠换 (实线代表转换，虚线代表颠换)
染色体畸变 染色体畸变是一些不发生染色体数目变化而在染色体上有较大范围结构改变的变异，是由DNA(RNA)的片段缺失、重复或重排而造成染色体异常的突变。其中包括以下变化：一是易位，指两条非同源染色体之间部分相连的现象。它包括一个染色体的一部分连接到某一非同源染色体上的单向易位以及两个非同源染色体部分相互交换连接的相互易位。二是倒位，指一个染色体的某一部分旋转180度后以颠倒的顺序出现在原来位置的现象。三是缺失，指在一条染色体上失去一个或多个基因的片段，这是造成畸变的缺失。四是重复，指在一条染色体上增加了一段染色体片段，使同一染色体上某些基因重复出现的突变。发生染色体畸变的微生物往往易致死，所以微生物中突变类型的研究主要是在基因突变方面。
2.1.2. 从突变所带来的表型的改变来讲，突变的类型可以分为以下几 类：
形态突变型 指细胞形态结构发生变化或引起菌落形态改变的那些突变类型。包括影响细胞形态的突变型以及影响细菌、霉菌、放线菌等的菌落形态以及影响噬菌体的噬菌斑的突变型。例如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无，菌落的大小，外形的光滑或粗糙及颜色的变异；放线菌或真菌产孢子的多少，外形及颜色的变异；噬菌斑的大小和清晰程度的变异等。
致死突变型 指由于基因突变而造成个体死亡的突变类型，造成个体生活力下降的突变型称为半致死突变型。一个隐性的致死突变基因可以在二倍体生物中以杂合状态保存下来，可是不能在单倍体生物中保存下来，所以致死突变在微生物中研究得不多。
条件致死突变型 这类突变型的个体只是在特定条件，即限定条件下表达突变性状或致死效应，而在许可条件下的表型是正常的。广泛应用的一类是温度敏感突变型，这些突变型在一个温度中并不致死，所以可以在这种温度中保 存下来；它们在另一温度中是致死的，通过它们的致死作用，可以用来研究基因的作用等问题。
营养缺陷突变型 是一类重要的生化突变型。是指某种微生物经基因突变而引起微生物代谢过程中某些酶合成能力丧失的突变型，它们必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长繁殖。这种突变型在微生物遗传学研究中应用非常广泛，它们在科研和生产中也有着重要的应用价值。
抗性突变型 是指一类能抵抗有害理化因素的突变型，细胞或个体能在某种抑制生长的因素(如抗生素或代谢活性物质的结构类似物)存在时继续生长与繁殖。根据其抵抗的对象分抗药性、抗紫外线、抗噬菌体等突变类型。这些突变类型在遗传学基本理论的研究中非常有用，常以抗性突变为选择标记，特别在融合试验、协同转染实验中用得最多。
抗原突变型 是指细胞成分，特别是细胞表面成分如细胞壁、荚膜、鞭毛的细致变异而引起抗原性变化的突变型。
其它突变型 如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和数量以及对某种药物的依赖性等的突变型。
这几类突变型并不是彼此排斥的。营养缺陷型也可以认为是一种条件致死突变型，因为在没有补充给它们所需要的物质的培养基上它们不能生长。某些营养缺陷型也具有明显的形态改变。例如粗糙脉胞菌和酵母菌的某些腺嘌呤缺陷型分泌红色色素。所有的突变型可以认为都是生化突变型，最为常见的是营养缺陷型。抗药性突变也是微生物遗传学中常用的一类生化突变型。因为任何突变，不论是影响形态的或是致死的，都必然有它的生化基础。突变型的这一区分不是本质性的。
2.1.3. 按突变的条件和原因划分，突变可以分为自发突变和诱发突变。
自发突变 是指某种微生物在自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。在过去相当长的时间里，人们认为自发突变是由于自然界中存在的辐射因素和环境诱变剂所引起的。然而深入研究表明这种看法不够完全。绝大多数的自发突变起源于细胞内部的一些生命活动过程，如遗传重组的差错和DNA复制的差错，这些差错的产生与酶的活动相关联。
DNA复制是非常精确的，细菌的DNA多聚酶具有聚合3’至5’的外切功能，它可以切除掺入到合成链的3’端和样板链不互补的错配碱基。通过这种复制中的校正作用，大大减少了碱基的错配，提高了复制合成的精确度。根据计算，这种校正可以把复制错误减少到10-10／碱基对，即每复制1010碱基对，只发生一次错误的掺入。细菌碱基组含有3×l06碱基对，复制一次发生错误的机会是3×10-4，假设基因的大小为l03碱基对，则可推算出细菌在一个增殖世代中，每个基因的突变率平均为10-7左右。考虑到自发突变中的大多数是检测不出来的沉默突变，所以，对于多数可检突变来讲，自发突变率为10-8左右。
DNA复制中的碱基错配、跳格，DNA聚合酶结构变异等均是提高自发突变的原因。在序列相似的DNA片段间的重组过程中，特别容易发生重组差错，从而造成一个或几个碱基的重复和缺失；基因重组是由重组酶来催化的，重组酶结构的变异也会影响基因的自发突变率。总之，各种DNA复制和基因重组过程有关的酶和蛋白，对维持生物基因自发突变率起着重要的，决定性的作用。
诱发突变 是利用物理的或化学的因素处理微生物群体，促使少数个体细胞的DNA分子结构发生改变，基因内部碱基配对发生错误，引起微生物的遗传性状发生突变。凡能显著提高突变率的因素都称诱发因素或诱变剂。
物理诱变 利用物理因素引起基因突变的称物理诱变。物理诱变因素有：紫外线、X-射线、γ-射线、快中子、β-射线、激光和等离子等。
化学诱变 利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。
复合处理及其协同效应 诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对育种很有意义。复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用。
定向培育和驯化 定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。
2.2. 基因突变的特点
在生物界中由于遗传变异的物质基础是相同的，因此显示在遗传变异的本质上也具有相同的规律，这在基因突变的水平上尤其显得突出。
自发性 由于自然界环境因素的影响和微生物内在的生理生化特点，在没有人为诱发因素的情况下，各种遗传性状的改变可以自发地产生。
稀有性 自发突变虽然不可避免，并可能随时发生，但是突变的频率极低，一般在10-6~10-9之间。
诱变性 通过各种物理、化学诱发因素的作用，可以提高突变率，一般可提高10~106倍。
突变的结果与原因之间的不对应性 即突变后表现的性状与引起突变的原因之间无直接对应关系。例如抗紫外线突变体不是由紫外线而引起，抗青霉素突变体并也不是由于接触青霉素所引起。
独立性 在一个群体中，各种形状都可能发生突变，但彼此之间独立进行。
稳定性 突变基因和野生型基因一样，是一个相对稳定的结构，由此而产生的新的遗传性状也是相对稳定的，可以一代一代地传下去。
可逆性 原始的野生型基因可以通过变异成为突变型基因，此过程称为正向突变；相反，突变型基因也可以恢复到原来的野生型基因，称回复突变。实验证明任何突变既有可能正向突变，也可发生回复突变，二者发生的频率基本相同。
2.3. 基因突变的机制
DNA分子中碱基对的变化可以在自然条件下自发地发生，也可以人为的应用物理、化学因素诱导发生，它们的变化机制主要有以下几类：
2.3.1. 自发突变机制
虽然自发突变是指微生物在没有人工参与的条件下发生的突变，但是这决不意味这种突变是没有原因的，只是人们到现在对它还没有认识清楚而已。下面讨论几种自发突变的可能机制。
多因素低剂量的诱变效应 不少自发突变实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因素长期作用的综合结果。早在20世纪30年代中就认为任何剂量的X射线都足以诱发突变，因此有人认为宇宙空间拥有的各种短波辐射是自发突变的原因之一。根据计算，它至多只能说明自发突变的1%。自然界中还存在着能诱发突变的低浓度物质，由于偶然接触它们可能引起自发突变。除此以外，热也是诱发自发突变的一种影响因素，例如噬菌体T 4在370 C中每天每一GC碱基对以4×10-8这一频率发生变化，因此一些自发突变来自热的诱变作用。
A、 B正常配对；C、D、E、F嘌呤-嘧啶错配；G、H、I、J嘌呤-嘌呤错配
图5－9. 各种碱基错配
微生物自身代谢产物的诱变效应 已经发现在一些微生物中具有诱变作用的物质，例如咖啡碱、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸等。过氧化氢是微生物正常代谢的一种产物，它对脉胞菌具有诱变作用，如果同时加入过氧化氢酶抑制剂，则可提高诱变的效率。这说明过氧化氢有可能是引起自发突变的一种内源诱变剂。
互变异构效应 由于DNA分子中的A、T、G、C四种碱基的第六位碳原子上的酮基(T、G)和氨基(A、C)，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）不是酮式就是烯醇式，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）不是氨基式就是亚氨基式。所以有人认为T和G会以酮式和烯醇式两种互变异构的形式出现，而A和C则以氨基式或亚氨基式两种状态出现。由于化学结构的平衡一般趋向于酮式和亚氨基式，因此，在DNA双链结构中一般总是以AT与GC碱基配对的形式出现（图5－9A、B ）。可是在偶然情况下，T也会以烯醇式形式出现，恰好DNA的合成到达这位置的一瞬间，通过DNA多聚酶的作用，在它相对应的位置上出现配对碱基G，而不出现常规的A（图5－9D）。当DNA再次复制时，通过G和C配对，就使原来的AT转变为GC。同样如果C以亚氨基形式出现，在DNA复制的合成到达这位置的一瞬间，DNA对应链上将是A，而不是G（图5－9 C）。以此类推，这些可能是引起自发突变的重要原因之一。
除了由于酮式—烯醇式互变和氨基式—亚氨基式互变而造成的碱基错配以外，还可能发生另一种嘌呤-嘌呤错配。这种错配来源于另一种由于碱基-脱氧核糖键旋转而造成的称为正-反的互变。根据DNA模型制作结果，证明腺嘌呤的亚氨基式能和腺嘌呤或鸟嘌呤的正式配对(图5－9G、I)，鸟嘌呤的烯醇兼亚氨基式能和鸟嘌呤或腺嘌呤的正式配对(图5－9H、J)，这些错配也能通过DNA复制而造成转换和颠换(图5－10)。
从图5－10可以看到，由酮式—烯醇式互变或氨基式—亚氨基式互变可以引起转换，由正式—反式互变可以引起颠换。正式—亚氨基式配对或正式—烯醇式兼正式配对不容易形成，所以颠换应少于转换。
图5－10. 由错配所引起的突变
环状突变效应 近来还有人提出另一种造成自发突变的原因，它可以称为环状突变效应或简称环出效应。如图5－11A所示，当DNA复制到C时，模板链G向外环出；当复制继续进行时模板又恢复正常。结果在原来应出现GC 碱基对的 地方出现了GA碱基对。再经一次DNA复制时，便会出现TA，因此造成了GC -TA颠换。图5－11B 中，环出的是两个核苷酸，这样就会导致相邻的两对碱基发生变化。如果这两对碱基属于两个密码，那么一次突变可以使两个密码发生变化，带来两个氨基酸的改变。关于这一突变机制模型还缺乏实验根据，但它同样指出，DNA结构的另一种瞬时的可逆性变化，可能导致基因突变。自然突变的偶然性在这里可以得到解释。
—T—T—C— —T—T—C—A— —T—T—C—A—A—T—
A —A—A—G—G—T—A —A—A—G T—A— —A—A—G—G—T—A—
\ /
G
—G—T— —G—T—A—T— —G—T—A—T—A—T—
B —C—A—A—G—T—A— —C—A T—A— —C—A—A—G—T—A—
A—G
A单个核苷酸环出 B两个核苷酸环出
图5－11. 核苷酸环出诱变
2.3.2. 诱发突变的机制
诱发突变就是人类对突变过程的某种干扰，这种干扰往往是了解、掌握和改变自然变化的起点。诱发突变为我们研究突变机理创造了条件。诱发机制主要有以下几类：
碱基对的置换 在DNA分子上，碱基对置换属于一种微小的损伤，它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。碱基对的置换可分成两类：一类是转换；另一类是颠换。对某一种具体的诱变剂引起的碱基对置换。即可同时有转换和颠换两类，也可只具有其中的一个功能。碱基对的置换绝大多数是由化学诱变剂通过直接或间接的方式引起，因此可以把置换的机制分为两类。
直接引起置换的诱变剂是一类可直接与核酸碱基发生化学反应的诱变剂，不论在生物体内或离体条件下均有作用。这类诱变剂的种类很多，常用的主要有各种烷化剂、亚硝酸和羟胺。它们可以与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起GC—AT转换外其余都是GC---AT互变的。
烷化剂是诱变育种极其重要的一类诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基，并能转移到其它分子中电子密度极高的位置上去。这种活性烷基的数目表示它具有单功能、双功能或多功能。常见的烷化剂有硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)、N-亚硝基-N-甲基-氨基甲酸乙酯 (NMU)、乙烯亚氨(EI)、环氧乙酸(EO)、氮芥(NM)等，所有这些物质通过烷化磷酸基、烷化嘌呤和烷化嘧啶与DNA作用，其中烷化鸟嘌呤是最易发生的作用，且形成7-烷基鸟嘌呤。烷化剂对于点突变的诱变作用可能主要是由于引起碱基的错误配对。另外烷化剂还能诱发染色体畸变，由于染色体畸变常为辐射所诱发，所以这些物质又称为拟辐射物质。
亚硝酸常用于诱发真菌突变，是一种对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换的诱变剂。它能使碱基中的氨基氧化脱去，从而使胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U)，引起GC-AT的转换；腺嘌呤(A)变成次黄嘌呤(H)，引起AT-GC的转换；鸟嘌呤(G)变成黄嘌呤( (X)，不引起碱基对的转换。亚硝酸还能引起DNA两链间的交联而引起DNA结构上的缺失作用。它很不稳定，易分解为水和亚硝酐 。
羟胺几乎只和胞嘧啶发生反应而不和其它三种碱基发生，故几乎只引起GC- AT的转换，而不引起AT -GC的转换。羟胺还能和细胞中的其他一些物质发生反应而产生过氧化氢等，而过氧化氢则是一种非专一性的诱变剂。所以羟胺对于游离噬菌体和转化因子等能引起非常专一性的突变，可是对于活体来讲则专一性就比较差了。
间接引起置换的诱变剂是一些碱基结构类似物，例如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)及6-氮嘌呤(6-NP)等。机体缺乏天然碱基时，易通过活化细胞的代谢活动掺人到DNA分子中去，引起碱基配对发生错误。在这些碱基类似物中，最常被应用的是5-溴尿嘧啶(5-BU)和2-氨基嘌呤(2-AP)。5-溴尿嘧啶(5-BU)是胸腺嘧啶(T)的结构类似物。当微生物生长于含有5-BU的培养液中并合成DNA时，如果5-BU以烯醇式状态存在于DNA中，与它配对的是鸟嘌呤，进而经DNA复制，引起AT至CG的转换；如果5-BU 以酮式状态存在于DNA中，就不会引起碱基对的置换；另外，5-BU也可以通过烯醇式和酮式结构的变化，引起GC至AT的回复突变过程。但是在5-BU的酮式和烯醇]式两种结构中，出现烯醇式的几率更多，这样也就增加了AT转换变为GC的突变几率。2-氨基嘌呤是腺嘌呤的结构类似物，它能代替A进入DNA分子中与T配对有两个氢键，结合的程度较牢固；它也能与C形成只有一个氢键的碱基对，结合得较弱。随后经DNA复制，C与G配对完成AT至CG的转换，且这种转换多是单方向的，因为2-氨基嘌呤较难代替G而被C吸引。
移码突变 这是由于DNA分子中一对或少数几对核苷酸的增加或缺失而造成的基因突变。由于遗传信息是以三对核苷酸为一组的密码形式表达的，所以一对或少数几对核苷酸的增加或缺失往往造成增加或缺失位置后面的密码意义全部发生错误。与染色体畸变相比，移码突变也属于DNA分子中的微小损伤。吖啶类染料及其化合物是有效的移码突变诱变剂，例如吖啶、吖啶黄、吖啶橙，5-氨基吖啶。吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶碱基对相似，因此能够插入DNA分子中两个相邻的碱基之间，使得DNA分子的长度增加，造成双螺旋一定程度的延长和部分解开。从而在复制过程中，会使链上增加或缺失一个碱基，结果引起增加或缺失位置之后全部遗传密码转录翻译的错误，造成移码突变。
染色体畸变 是指引起DNA分子较大损伤的诱变，包括染色体结构上的易位、倒位、缺失、重复等。紫外线、x射线、γ射线等射线、亚硝酸及烷化剂等均是引起染色体畸变的有效的诱变剂。它们能引起DNA分子多处较大的损伤，如DNA链的断裂，DNA分子内两条单链的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚体的形成等。烷化剂根据其烷化作用分单功能、双功能、三功能的烷化剂，其中一些单功能烷化剂（如NG、EMS等）常被称为超诱变剂，它们虽然杀伤力较低但却有较强的诱变作用。烷化剂分子能烷化DNA分子上的碱基，造成一条单链的断裂或两条单链的交联等，引起染色体畸变。紫外线作用的主要机制是：在同链DNA相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的嘧啶二聚体。胸腺嘧啶二聚体如在互补链间形成就会妨碍双链的解开，从而影响DNA复制和转录，并使细胞死亡；如在同链DNA上形成就会减弱或消除DNA双链间氢键的作用，并引起双链结构的扭曲变形，阻碍碱基间正常的配对，从而引起突变或死亡。微生物能以多种形式去修复被紫外线损伤后的DNA，主要方式有光复活、切除修复、重组修复、紧急呼救修复等。
光复活作用 经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显的降低其死亡率的现象称为光复活作用。光复活作用首先于1949年在放线菌中发现。引起的原因是可见光所激活的酶在起作用，经紫外线照射后形成胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会与一种光激活酶结合形成复合物，当再暴露在下可见光时，复合物会因获得光能而使酶与DNA分子解离，从而使胸腺嘧啶二聚体重新分散成两个胸腺嘧啶单体，同时光激活酶也从复合物中释放出来。由于微生物中一般都存在着光复活作用，因此用紫外线照射菌液时，要在红灯下进行操作处理，然后再于暗室中或用黑布包起来培养。
切除修复作用 也称暗修复作用，这种修复作用与光无关，整个修复过程是在四种酶的协同作用下进行的将胸腺嘧啶切除的 DNA损伤修复：核酸内切酶胸腺嘧啶在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口；核酸外切酶从5’-P至3’-0H方向切除二聚体；cDNA聚合酶以DNA的另一条互补链作模板，从原有链上暴露的3’-0H端起逐渐延长，重新合成一段缺损的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的那段DNA 的3’-OH末端与原来的5’-P末端相连接，形成一个完整的双链结构。
重组修复作用 又称为复制后修复，必须在DNA进行复制的情况下进行。重组修复可以在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下，以带有二聚体的这一单链为模板而合成互补单链，可是在每一个二聚体附近留下一个空隙。一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着胸腺嘧啶二聚体而是面对着正常的单链，在这种情况下DNA多聚酶和连接酶便能起作用而把空隙部分进行修复。
紧急呼救(SOS)修复系统 这是细胞经诱导产生的一种修复系统。它的修复功能依赖于某些蛋白质的诱导合成，而且这些蛋白质是不稳定的。SOS修复功能和细菌的一系列生理活动有关，如细胞的分裂抑制、λ噬菌体的诱导释放，以及引起DNA损伤的因素和抑制DNA复制的许多因素都能引起SOS反应。
x射线和γ射线属于能量很高的电离辐射，能产生电离作用，直接或间接地使DNA结构发生改变。直接的效应是碱基的化学键、脱氧核糖的化学键和糖酸相连接的化学键断裂；间接的效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基，这些自由基作用于DNA分子，引起缺失和损伤。此外还能引起染色体畸变，导致染色体结构上的缺失、重复、倒位和易位。
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