第3节 食品制造中的霉菌及其应用
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霉菌在食品加工工业中用途十分广泛，许多酿造发酵食品、食品原料的制造，如豆腐乳、豆豉、酱、酱油、柠檬酸等都是在霉菌的参与下生产加工出来的。绝大多数霉菌能把加工所用原料中的淀粉、糖类等碳水化合物、蛋白质等含氮化合物及其它种类的化合物进行转化，制造出多种多样的食品、调味品及食品添加剂。不过，在许多食品制造中，除了利用霉菌以外，还要有细菌、酵母的共同作用下来完成。在食品酿造业中，常常以淀粉质为主要原料。只有将淀粉转化为糖才能被酵母菌及细菌利用。
3.1 生产用霉菌菌种
淀粉的糖化、蛋白质的水解均是通过霉菌产生的淀粉酶和蛋白质水解酶进行的。通常情况是先进行霉菌培养制曲。淀粉、蛋白质原料经过蒸煮糊化加入种曲，在一定温度下培养，曲中由霉菌产生的各种酶起作用，将淀粉、蛋白质分解成糖、氨基酸等水解产物。
在生产中利用霉菌作为糖化菌种很多。根霉属中常用的有日本根霉(Rhizopus japonicus AS3. 849)、米根霉(Rhizopus oryzae)、华根霉(Rhizopus chinensis〉等；曲霉属中常用的有黑曲霉(Aspergillus niger)、宇佐美曲霉(Asp. usamii)、米曲霉(Asp. oryzae)和泡盛曲霉(Asp. awamori)等；毛霉属中常用的有鲁氏毛霉(Mucor rouxii)，还有红曲属(Monascus)中的一些种也是较好的糖化剂，如紫红曲霉(Monascus. Purpurens)、安氏红曲霉(Monascus. anka)、锈色红曲霉(Monascus. rubiginosusr)、变红曲霉(Monascus. serorubescons AS3.976)等。
3.2 酱类
酱类包括大豆酱、蚕豆酱、面酱、豆瓣酱、豆豉及其加工制品，都是由一些粮食和油料作物为主要原料，利用以米曲霉为主的微生物经发酵酿制的。酱类发酵制品营养丰富，易于消化吸收，即可作小菜，又是调味品，具有特有的色、香、味，价格便宜，是一种受欢迎的大众化调味品。
用于酱类生产的霉菌主要是米曲霉（Asp.oryzae），生产上常用的有沪酿3.042，黄曲霉Cr-1菌株（不产生毒素），黑曲霉（Asp. Nigerf-27）等。所用的曲霉具有较强的蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶的活力，它们把原料中的蛋白质分解为氨基酸，淀粉变为糖类，在其他微生物的共同作用下生成醇、酸、酯等，形成酱类特有的风味。
市场上的豆酱种类繁多，其生产酿造工艺也不尽相同，生产用原辅料差异很大。下面是大豆酱的生产工艺。
3.2.1 制曲工艺
1) 制曲工艺流程
水 水 面粉 种曲
↓ ↓ ↓ ↓
大豆→洗净→浸泡→蒸煮→冷却→混合→接种→厚层通风培养→大豆曲
2) 制曲原料的处理
大豆洗净、浸泡及蒸熟；面粉在过去采用炒焙方法，现在有些厂家直接利用生面粉而不预以处理。
3) 制曲操作
制曲时原料配比为大豆100kg，标准粉40~60kg。种曲用量为0.15%~0.3%，种曲使用时先与面粉拌和。为了使豆酱中麸皮含量减少，种曲最好用分离出的孢子（曲精）；由于豆粒较大，水分不易散发，制曲时间适当延长。
4) 制酱
①工艺流程
配制→澄清→盐水加热————————————∣
↓ ↓
大豆曲→发酵容器→自然升温→加第一次盐水→酱醅保温发酵→加第二次盐水及盐→翻酱→成品
② 制酱工艺
先将大豆曲倒入发酵容器内，表面扒平，稍予压实，很快会自然升温至40℃左右。在将准备好的14.5oB′热盐水（加热至60~65℃）加至面层，让它逐渐全部渗入曲内。最后面层加封面用细盐一层，并将盖盖好。大豆曲加入热盐水后，醅温即能达到45℃左右，以后维持此温度10d，酱醅就成熟。发酵完毕，补加240Be′盐水及所需细盐（包括封面盐），压缩空气或翻酱机充分搅拌，务使所加的细盐全部溶化，同时混合均匀，在室温中后发酵即的成品。
3.3 酱油
酱油是人们常用的一种食品调味料，营养丰富，味道鲜美，在我国已有两千多年的历史。它是用蛋白质原料(如豆饼、豆柏等)和淀粉质原料(如麸皮、面粉、小麦等)，利用曲霉及其他微生物的共同发酵作用酿制而成的。
酱油生产中常用的霉菌有米曲霉、黄曲霉和黑曲霉等，应用于酱油生产的曲霉菌株应符合如下条件：不产黄曲霉毒素；蛋白酶、淀粉酶活力高，有谷氨酰胺酶活力；生长快速、培养条件粗放、抗杂菌能力强；不产生异味，制曲酿造的酱制品风味好。
3.3.1 酱油生产霉菌
酱油生产所用的霉菌主要是米曲霉(Asp. Oryzae)。生产上常用的米曲霉菌株有：AS 3.951(沪酿3.042)；UE328、UE336；AS 3.863；渝3.811等。
生产中常常是由两菌种以上复合使用，以提高原料蛋白质及碳水化合物的利用率，提高成品中还原糖、氨基酸、色素以及香味物质的水平。除曲霉外，还有酵母菌、乳酸菌参与发酵，它们对酱油香味的形成也起着十分重要的作用。
3.3.2 种曲原料及其配比
目前一般采用的几种配比：
麸皮80kg、面粉（或甘薯干粉）20kg、水70kg左右； 麸皮85kg、面粉85kg、水90kg、麸皮100kg、水95~100kg；
3.3.3 原料处理
先将麸皮与辅料用拌和机拌匀，再加水充分拌和。由于一次加水蒸煮后熟料粘度高，团快多，过筛困难，应采用两次润水方法。即在混合原料中先加40%~50%的水，蒸熟过筛后再补充清洁的冷开水30%~45%。为防止杂菌的污染，可在冷开水中添加按总原料计0.3%的食用级冰醋酸或0.5~1%的醋酸钠拌匀。蒸料时先开起蒸汽，排尽冷水，分层进料。注意原料必须洒于冒蒸气处，洒料要求松散，切忌将原料压实而堵塞蒸气，导致蒸料不匀。进料完毕、全面冒汽后加盖蒸煮。常压蒸煮冒汽后维持1h，焖30min，或采用加压蒸煮0.1Mpa维持30min出锅，然后过筛，移入拌和台上摊开，适当翻拌，使之快速冷却。
3.3.4 种曲制备
1) 工艺流程
一级种→二级种→三级种
↓
麸皮、面粉→加水混合→蒸料→过筛→冷却→接种→装匾→曲室培养→种曲
2) 试管斜面菌种培养
① 培养基
5°Be′豆饼汁100ml，MgSO4 0.05g，NaH2PO4 0.1g，可溶性淀粉2.0g，琼脂1.5g，0.1MPa蒸汽灭菌30min，制成斜面试管。
② 培养
将菌种接入斜面，置30℃培养箱中培养3d，待长出茂盛的黄绿色孢子，并无杂菌，即可作为三角瓶菌种扩大培养。
3) 三角瓶纯菌种扩大培养
① 培养基
麸皮80g，面粉20g，水80-90ml或麸皮85g，豆饼粉15g，水95ml。原料混合均匀分装入带棉塞的三角瓶中，瓶中料厚度1cm左右，在0.1MPa蒸汽压力下灭菌30min，灭菌后趁热摇松曲料。
② 培养
曲料冷却后接入试管斜面菌种，摇匀，置30℃培养箱内培养18h左右，当瓶内曲料已发白结饼，摇瓶一次，将结块摇碎，继续培养4h，再摇瓶一次，经过2d培养，把三角瓶倒置，以促进底部曲霉生长，继续培养1d，待全部长满黄绿色的孢子即可使用。若放置较长时间，应阴凉处或冰箱中。
4) 种曲培养
① 曲料配比
目前一般采用的配比有两种： 麸皮80kg，面粉20kg，水70kg左右；麸皮100kg，水95~100kg。加水量应视原料的性质而定。根据经验，使拌料后的原料能捏成团，触之即碎为宜。原料拌匀后过3.5目筛。堆积润水1h，0.1MPa蒸汽压下蒸料30min，或常压蒸料1h再焖30min 。要求熟料疏松，含水量50%~54%。
② 培养
待曲料品温降至40℃左右即可接种，将三角瓶的种曲散布于曲料中，翻拌均匀，使米曲霉孢子与曲料充分混匀，接种量一般为0.5%~1%。制种曲的两种常用方法：
a 竹匾培养
接种完毕，曲料移入竹匾内摊平，厚度约2cm，种曲室温度控制在28~30℃，培养16h左右，当曲料上出现白色菌丝，品温升高到38℃左右时可进行翻曲。翻曲前调换曲室的空气，将曲块用手捏碎，用喷雾器补加40℃左右的无菌水，补加水量40%左右，喷水完毕，再过筛1次，使水分均匀。然后分匾摊平，厚度1cm，上盖温纱布，以保持足够的温度。翻曲后，种曲室温控制在26~28℃之间，4~6h后，可见面上菌丝生长，这一阶段必须注意品温，随时调整竹匾上下位置及室温，务使品温不超过38℃，并经常保持纱布潮湿，这是制好种曲的关键。若品温过高，会影响发芽率。再经过10h左右，曲料呈淡黄绿色，品温下降至32~35℃。在室温28~30℃下，继续培养35h左右，曲料上长满孢子，此时可以揭去纱布，开窗放出室内湿气，并控制室温略高于30℃，以促进孢子完全成熟。整个培养时间需68-72h。
b 曲盘培养
接种完毕，曲料装入曲盘内，将曲盘柱形堆叠于曲室内，室温28~30℃，培养16h左右。当曲面面层稍有发白、结块，品温达到40℃时，进行第一次翻曲。翻曲后，曲盘改为品字形堆叠，控制品温28~30℃，4~6h后品温上升到36℃，即进行第二次翻曲。每翻毕一盘，盘上盖灭菌的草帘一张，控制品温36℃，再培养30h后揭去草帘，继续培养24h左右，种曲成熟。
3.3.5 成曲生产
1) 工艺流程
种曲
↓
原料→粉碎→润水→蒸料→冷却→接种→通风培养→成曲
2) 发酵
① 原料的选择和配比
酱油生产中是以酿制酱油的全部蛋白质原料和淀粉质原料制曲后，再经发酵生产酱油的。所以制曲原料的选用，即要满足米曲霉正常生长繁殖和产酶，又要考虑到酱油本身质量的需要。脱脂大豆的蛋白质含量非常丰富，宜作原料；麸皮质地疏松，适合于米曲霉的生长和产酶，因此，可以作辅料。制曲的配比生产厂家不进相同。酱油的鲜味主要来源于原料中的蛋白质分解产物氨基酸，而酱油的香甜则来源于原料中淀粉分解产物糖及发酵生成的醇、酯等物质，所以，若需酿制香甜味浓厚、体态粘稠的酱油，则在配比中要适当增加淀粉质原料。使用豆粕（豆饼）和麸皮为原料，常用的配比是：8：2、7：3、6：4和5：5。
② 制曲原料的处理
a 原料粉碎及润水
豆饼粉碎使其有适当的粒度，便于润水和蒸煮。一般若原料颗粒小，则表面积大，米曲霉生长繁殖面积大，原料利用率高。粉碎后的豆饼与麸皮按一定的比例充分的拌匀后，即可进行润水。所谓润水，就是给原料加上适当的水分，并使原料均匀而完全地吸收水分的工艺。其目的在于使原料吸收一定量水分后膨胀、松软，在蒸煮时蛋白质容易达到适度的变性；淀粉充分的糊化；溶出曲霉生长所需的营养成分，也为曲霉生长提供了所需的水分。
b 原料蒸料
使原料中蛋白质达到适度变性，成为酶易作用的状态。使原料中的淀粉充分糊化，以利于糖化；杀灭原料中的杂菌，减少制曲时的污染；要蒸料均匀并掌握蒸料的最适程度，达到原料蛋白质的适度变性；防止蒸料不透或不均匀而存在未变性的蛋白质，或蒸煮过度而过度变性使蛋白质发生褐变现象。蒸料的设备目前国内蒸煮设备有三种类型，即常压蒸煮锅、加压蒸煮锅和连续管道蒸煮设备。目前国内酱油厂大多使用旋转式加压蒸煮锅。
③ 厚层通风制曲
就是将曲料置于曲池（也称曲箱）内，其厚度增至30cm左右，利于通风机供给空气及调节温度，促使半曲霉迅速生长繁殖。
a 制曲时原料的物理变化
曲霉在曲料上生长的变化：曲料制种进入曲箱后，米曲霉得到适当的温度和水分，开始发芽生长。曲霉的最适发芽温度为30~32℃。通风制曲开始时的堆积，品温以维持32℃左右为宜。在最初的4~5d是米曲霉的孢子发芽阶段，所以成为孢子发芽期。
b 制曲时霉菌的生物学变化
孢子发芽后，接着生长菌丝。当静止培养8h左右时，品温已逐渐上升到36℃，需要进行间歇或连续通风，一方面调节品温，另一方面换新鲜空气，以利米曲霉生长。继续维持品温在35℃左右，培养12h左右，当肉眼稍见曲料发白时进行第一次翻曲，称为菌丝生长期。
④ 固态低盐发酵
在酱油发酵过程中，根据醪醅的状态，有稀醪发酵、固态发酵及固稀发酵之分；根据加盐量的多少，可分为高盐发酵、低盐发酵和无盐发酵三种；根据加温状况不同，又可分为晒夜露与保温速酿两类。
a 工艺流程
成曲→打碎→加盐水拌合(在12~13°Be′，55℃左右的盐水，含水量50%~55%等条件下)→保温发酵(50~55℃，4~6d)→成熟酱醅
b 固态低盐发酵工艺
a) 食盐水的配制
食盐溶解后，以波美计测定其浓度，并根据当时温度调整到规定的浓度。一般经验是100kg水加盐1.5kg左右得盐水10°Be′，但往往因食盐质量不同及温度不同而需要增减用盐量。采用波美计检定盐水浓度二般是以20℃为标准温度，而实际生产上配制盐水时，往往高于或低于此温度，因此，必须换算成标准温度。
b) 发酵料的配制
先将已准备好的糖浆盐水加热到50~55℃(根据下池后发酵品温的要求，掌握糖浆盐水温度的高低)，再将成曲通过制醅机的碎曲齿，由升高机的提升斗，输入螺旋拌和器中与糖浆盐水一起拌和均匀，落人发酵池内。初开始时，池底15cm左右的成曲拌糖浆盐水略少，以后用阀门掌握成曲与糖浆盐水的流速数量，使拌曲完毕后，多出150kg左右的糖浆盐水，将此糖浆盐水浇于料面。待糖浆盐水全部吸人料内，最后面层加盖聚乙烯薄膜，四周加盐将膜压紧，并在指定的点上插入温度计，池面加盖。
如果不用酶法生产，即将淀粉质原料与豆饼一起混合，经过润水、蒸煮及制曲后，直接加入12~180°Be′热盐水(55℃左右)，
c) 保温发酵及管理
保温发酵时温度与时间的掌握，各厂根据设备情况及要求的不同而各异。发酵时，成曲与糖浆盐水拌和人池后，酱醅品温要求在42~46℃之间，保持4d，在此期间，品温基本稳定，夏天不需要开蒸气保温，冬天如醋温不足需要进行保温。从第5d起按每天开汽3次的办法使品温逐步上升，最后提高到48~50℃。低盐发哮的时间一般为10d，酱醅已基本上成熟。但为了增加风味，往往延长发酵期12~15d，发酵温度前期为42~44℃，中间为44~46℃，后期为46~48℃。有的厂还采用淋浇发酵的办法，酱醅面上不封盐，制醅后相隔2~3h将酱汁(曲液水)先回浇一次于酱醅内，使酶和水分较为均匀。发酵温度5d天内为40~45℃，5天后逐步提高品温至45~48℃。前4d每天淋浇两次，4d后每天淋浇一次。发酵期共为10d。淋浇对发酵是有好处的，使发酵温度均匀，酱汁中的酶充分利用，并且可以减少面层的氧化层，因而能提高酱油的风味。它的缺点是需要增加淋浇设备与淋浇操作，在工艺上带来不方便。
固态低盐发酵期间要有专人负责，按时测定酱醋温度，做好记录。冬天要防止四周及面层的酱醋温度过低。如发现不正常状况，必须及时采取适当的措施。
⑤ 浸出提油及成品配制
a 工艺流程
二油 三油 水
↓ ↓ ↓
加热 加热 加热
↓ ↓ ↓
成熟酱醅→第一次浸泡→头渣→第二次浸泡→二渣→第三次浸泡→残渣
↓ ↓ ↓
第一滤油 第二滤油 第三滤油
↓ ↓ ↓
头油 二油 三油
b 成品配制
以上提取的头油和二油并不是成品，必须按统一的质量标准或不同的食用用途进行配兑，调配好的酱油还须经灭菌、包装，并经检验合格后才能出厂。
3.4 柠檬酸
柠檬酸(Citric acid)分子式为C6H807。又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，具有另人愉快的强烈的酸味，相对密度为1.6550。柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有机溶剂。商品柠檬酸主要是无水柠檬酸和一水柠檬酸，前者在高于36.6℃的水溶液中结晶析出，后者在低于36.6℃水溶液中结晶析出。它天然存在于果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。柠檬酸是生物体主要代谢产物之一。早期的柠檬酸生产是以柠檬、柑桔等天然果实为原料加工而成的。1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的浅盘法柠檬酸发酵，并设厂生产。1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，各地陆续办厂投产，至20世纪70年代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系。
3.4.1 柠檬酸在食品中的应用
1) 饮料与冰淇淋
柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料。柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。
2) 果酱与酿造酒
柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。
当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。
3) 腌制品
各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。
4) 罐头食品
加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。
5) 豆制品及调味品
用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等）的调味。
6) 其它
柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。
3.4.2 柠檬酸发酵微生物
1) 黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特征
目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产菌。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。
2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理特征
黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般为pH3~7；产酸最适pH为1.8~2.5。生长最适温度为33~37℃，产酸最适温度在28~37℃，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在麦芽汁40Be′左右的培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。
3.4.3 柠檬酸发酵机理
关于柠檬酸发酵的机制虽有多种理论，但目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸（见发酵代谢）。
3.4.4 柠檬酸发酵用原料
柠檬酸发酵的原料有糖质原料(甘煎废糖蜜、甜菜废糖蜜)、淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木薯等)和正烷烃类原料三大类。
3.4.5 柠檬酸发酵工艺
1) 试管斜面菌种培养
察氏琼脂培养基：NaNO3 3g， 蔗糖20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自然。
察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0.5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分绿0.4g，琼脂20g， 蒸馏水1000ml， pH自然。
蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g， 麦芽汁20ml， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml。
米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。
2) 种子扩大培养
① 二级扩大培养
a 培养基
有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：
麦芽汁70BX， 氯化铵2%， 尿素0.1%，
b 培养
固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。
液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。
② 三级扩大培养
可采用麸曲固定培养、液体表面培养或琼脂固定培养。
所用培养基如下：
a 麸曲培养基：
新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。
b琼脂固体培养基：
与斜面培养基相同。
3） 发酵生产
① 工艺流程
以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程：
斜面菌种→麸曲瓶→种子
↓
薯干粉→调浆→灭菌(间歇或连续式)→冷却→发酵→发酵液→提取→成品
↑
无菌空气
以薯渣为原料的固体发酵工艺流程：
试管斜面→三角瓶菌种→种曲
↓
薯渣→粉碎→蒸煮→摊凉接种→装盘→发酵→出曲→提取→成品
↑
米糠
② 液体发酵
a不置换法
培养液一次加入，发酵结束后弃去菌盖，发酵液用来提取柠檬酸。具体操作是：接种后，培养温度维持在35℃，这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通人约50℃的空气以维持35℃的培养温度，通风量为3~5m3/m2.h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40℃左右，风量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。自接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，最高时可达1000kJ/(m2.h)，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在26~28℃，以利柠檬酸的形成。因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至15~18m3/m2.h，且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。
b 置换法
置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后，室温保持在34~36℃，培养液品温为32~34℃，使孢子发芽，正常情况下40h即可形成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基，更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降至30~32℃，待发酵48~60h后再放掉发酵液，加入新培养液即进行第2次置换。如此重复，一般可置换培养基8~10次，总发酵周期为14~20d，收集起来的发酵液，用来提取柠檬酸。置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度’快，而且原本不适宜长菌的原料却可用作发酵培养基。但为了保持菌盖的高活性，因此不能将发酵液残糖控制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液其残糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。
c 不置换法影响表面发酵的因素
a) 培养液层厚度
培养基液层厚度大，发酵产物总的生成量就大。如果原料质量好，预处理方法得当，曲霉菌丝体活力强，那末可适当增加液层厚度;相反，就应减少液层厚度。
b) 糖浓度
用于表面发酵的糖蜜浓度，质优的糖蜜浓度(以蔗糖浓度计)为18%~22%较适宜，而质劣的糖蜜一般采用14%。在表面发酵中，大约80%的糖被用于合成柠檬酸，菌体生长增殖耗糖8%左右，菌体进行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副产物。
c) 温度
黑曲霉适宜产酸温度是26~28℃。温度高，容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老；温度低，发酵周期被延长。
d) pH值
黑曲霉长菌的最适pH为中性，而产酸的最适pH在2.5~2.0。因此，应该注意的是：菌盖形成之后，只是在菌盖下面有一个低PH区域，菌体合成柠檬酸的活动都是在这低pH区域内进行的，所以不应该搅动发液，避免低值区域的pH值上升而长菌不产酸。
e) 通风
表面发酵是气相传氧，因此传氧效率较高，所以只要保持发酵室内有适当空气流通就可以满足霉菌对氧的需要。较高度的CO2会影响菌体的生长和降低产酸能力。一般将CO2控制在3%以下即可。
② 固体发酵
a 浅盘发酵
将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐渐下降，在入室后自18h内，应维持品温在27~31℃。培养18~48h期间，由于发酵热的大量释放，品温上升很快，应采取措施，不得让品温超过43℃，因为菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在35℃左右，直至发酵结束。为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应将曲盘上下对调。整个发酵期间不必翻曲。曲室相对湿度在85%~90%。发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次，在酸度达到最高时即出料，否则时间延长，柠檬酸反而被菌体消化。
b 厚层通风发酵
与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的15~20cm要大出许多。为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械通风。培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似，但最高品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻料。厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面积少，污染杂菌可能性小，机械化程度高。
3.5 苹果酸
L-苹果酸广泛存在于生物体中，是生物体三羧酸循环的成员。苹果酸广泛应用于食品领域。因为苹果酸具有比柠檬酸柔和的酸味，滞留时间长和口味更好的优点，所以作为食品酸味剂更为理想。
许多微生物都能产生苹果酸，但能在培养液中积累苹果酸并适合于工业生产的，目前仅限于少数几种，大致有：用于一步发酵法的黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉；用于两步发酵法的华根霉、无根根霉、短乳杆菌、膜睽毕赤酵母；用于酶转化法的短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌。
3.5.1 一步发酵法
以糖类为发酵原料，用霉菌直接发酵生产L-苹果酸的方法称为一步发酵法。
1) 菌种
一步发酵法采用黄曲霉A-114生产苹果酸。
2) 种子培养基组成(%)
C6H12O6 3，豆饼粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02，NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(单独灭菌)。
3) 种子培养
将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下并移接到装有100ml种子培养基的500m1三角瓶中，在33℃下静置培养2~4d，待长出大量孢子后，将其转入到种子罐扩大培养，接种量为5%。种子罐的培养基与三角瓶培养基的组成相同，只是另外添加0.4%(体积分数)泡敌。种子罐的装液量为70%，罐压0.1MPa，培养温度33~34℃，通风量0.15~0.3m3/m3.min，培养时间18~20h。
4) 发酵培养基组成
C6H12O6 7%~8%，其余成分的组成及用量与种子罐培养基相同。
5) 发酵
发酵罐的装液量为70%，接种量10%，罐压0.1MPa，培养温度33~34℃，通风量0.7m3/（m3.min)，搅拌转速180r/min，发酵时间40h左右。发酵过程中由自动系统控制滴加泡敌，防止泡沫产生过多。当残糖在1%以下时，终止发酵，产苹果酸7%。
3.5.2 两步发酵法
两步发酵法是以糖类为原料，先由根霉菌发酵生成富马酸(延胡索酸)和苹果酸的混合物，然后接人酵母或细菌，将混合物中的富马酸转化为苹果酸。
1) 富马酸发酵
① 菌种
两步发酵法以华根霉6508为菌种生产苹果酸。
② 斜面培养
华根霉6508于葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面上，30℃培养7d，易于长出大量孢子。
③ 摇瓶发酵
a 培养基组成(%)
C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10，MgSO4 0.05，FeCl3 0.002，CaCO3 5(单独灭菌)。
b 富马酸发酵
在500ml三角瓶中装入50ml培养基，灭菌，冷却。接种华根霉孢子，置往复式摇床上，于30℃下培养4~5d，发酵得到含富马酸和苹果酸的混合液。
c 转换发酵
a) 酶转化法
酶转化法是国外用来生产L-苹果酸的主要方法。酶转化法是以富马酸盐为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸(盐)。酶转化法可分为游离细胞酶法、固定化细胞酶法。
b) 游离细胞酶转化法
酶转化方法 在pH7.5含18%富马酸的溶液中接入2%湿菌体，于35℃、150r/min条件下转化24~36h。转化率达90%以上。
c) 固定化细胞酶转化法
目前，研究得最多的是以产氨短杆菌或黄色短杆菌为菌种，将化学法合成的富马酸钠作为底物，进行固定化细胞生产苹果酸。使用固定化细胞易于生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此，细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止这种副反应的发生。采用固定化技术必须注意以下几个问题：
细胞被固定前富马酸酶活力要高。当富马酸酶活力较高时，即使固定化细胞的酶活力有所下降，仍可以保证有较高的转化力；使用的固定化方法对酶的损害较小，细胞被固定后能保持较高的酶活力；细胞被固定后不应引起副反应的发生；固定化细胞应有高度的操作稳定性；
3.5.3 苹果酸的提取和精制
1) 从发酵醪液中提取苹果酸
① 工艺流程
发酵液→酸解→过滤→滤液→中和→过滤→沉淀→酸解→过滤→滤液→精制→浓缩→结品→干燥→成品
② 操作方法
在发酵醪液中边搅拌边加入无砷硫酸，将pH值调节至1.5左右；过滤除去沉淀后，在滤液中加入碳酸钙，直到不再有CO2放出，此时生成苹果酸钙；接着，用石灰乳将体系的pH值调至7.5，静置6~8h。过滤，收集苹果酸钙沉淀，并用少量冷水洗去沉淀中的残糖和其他可溶性杂质；在苹果酸钙盐中加入近一倍量的温水，搅拌成悬浊液，接着加入无砷硫酸，使pH达到1.5左右，继续搅拌30min，最后静置数小时，使石膏渣沉淀充分析出；过滤，制得粗制苹果酸溶液，其中含有微量富马酸、Fe2+、Ca2+、Mg2+和色素；从联合柱流出的高纯度苹果酸溶液，在70℃下减压浓缩到苹果酸浓度为65%~80%，然后冷却至20℃，添加晶种析晶；晶体于40~50℃下真空干燥，得苹果酸成品。
2) 从混杂富马酸发酵醪液中提取苹果酸
① 工艺流程
发酵廖液→浓缩→析出富马酸结晶→过滤→滤液→浓缩→析出富马酸结晶→过滤→滤液→冷却，加晶种→苹果酸结晶→干燥→成品
② 操作方法
将发酵醪液浓缩到苹果酸浓度为50%并冷却至20~30℃，使富马酸结晶析出；
过滤除去富马酸后，母液在70℃下减压浓缩到苹果酸浓度为65%~80%，再冷却至20℃使富马酸结晶再次析出。为了防止苹果酸与富马酸同时析出，造成苹果酸提取收率下降，结温度不宜低于20℃；
将过滤除去富马酸结晶后的苹果酸溶液冷却至20℃，投入苹果酸品种，缓慢搅拌，使苹果酸结晶徐徐析出。
2) 从酶法转化液中提取苹果酸
从固定化细胞反应柱中流出的酶法转化液是清亮的，其中苹果酸盐含量为12.5%左右，富马酸盐含量为3%左右。在上述转化液中加入硫酸，使富马酸结晶析出，过滤后往滤液中添加碳酸钙，使苹果酸形成苹果酸钙沉淀析出。将苹果酸钙沉淀用硫酸酸解，酸解液经阴离子交换树脂处理后浓缩结晶，得苹果酸成品。游离细胞酶法转化液在除去细胞和其他不溶物后，按上述方法处理。
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