材料与试剂

1．α－萘酚液

α一苯酚 1.00g

40%乙醇 100.00ml

3%H2O2 0.20ml

混合即可,现用现配。

2．派洛宁液

派洛宁(Pyroming) 0.10g

苯胺(Aniline) 4.00g

40%乙醇 96.00ml

3．内源性酶抑制剂：0.01%H2O2的0.01%的叠氮钠溶液。

1%H2 O2 1.00ml

1%Na N3 1.00ml

0.015mol/L pH 7.4 PBS液 100.00ml

4．0.05Mol/L pH 7.6 Tris－HCl缓冲液

A液：0.2mol/L Tris液

三羟甲基氨基甲烷 2.43g

H2 O 100.00ml

B液：0.1mol/L HCl

取A液25ml，B液38.9ml，混合，加蒸馏水至100ml即可。

5．DAB液(Karnovsky液)

0.05Mol/L pH 7.6 Tris－HCl缓冲液 100.00ml

3，3－二胺基联苯胺盐酸盐 76mg

1% H2 O2 0.5ml

配后立即使用。

6．0.10Mol/L pH7.4 PBS液。

操作方法

1．猪瘟酶标抗体工作滴度的确定 对组化法来说，最简单的确定工作滴度的方法是将酶标抗体进行一系列的倍比稀释，然后对已知阳性标本片进行染色，以最为清晰的阳性结果的最大稀释倍数或稍提高1～2滴度作为工作滴度。

购买商品猪瘟酶标抗体,则按其说明的工作浓度稀释即可。

2．待检标本片的制作 取可疑猪瘟病猪尸体或急宰病猪立即剖检，采取肾脏、脾脏、淋巴结等脏器进行触片(或涂片)或冷冻切片(4µm厚度)。余下组织低温冰箱保存或放于盛有50%甘油盐水中于普通冰箱保存，以备复检或比较用。也可采病猪之血作血球粥片。标本片干后，立即以4℃的丙酮液固定15min。固定后的标本片可贮藏于4℃冰箱中备用。

3．染色方法 采用单染法和复染法均可，萘酚复染法操作过程：

⑴ γ－苯酚液染色4min～5min。

⑵ 0.015Mol/L pH7.4 PBS液冲洗10min。

⑶ 派洛宁液染2min。

⑷ PBS冲洗后，用吸水纸吸除水滴。

⑸ 滴加工作浓度的酶标抗体液，以复盖为度，置湿盒内37℃温育30min~45min，PBS液冲洗。

⑹ 加DAB液室温染色30min；

⑺ PBS液冲洗后，馏水中漂洗；

⑻ 干燥后，无水酒精脱水5min，二甲苯透明5min，加拿大胶封片。

DAB单染法：

⑴ 滴加内源性酶抑制剂30min。

⑵ 0.015Mol/L pH 7.4 PBS冲洗液10min。

以下步骤同复染法⑸～⑻。

2．对照组的设置：首次染色时,应设立如下对照。

⑴ 已知阳性标本的对照。

⑵ 已知阴性标本的对照。

⑶ 抗体抑制试验对照，即在标本上加有与酶标抗体来源不同的另一个体的抗猪瘟抗体处理(37℃作用45min)。再以酶标抗体染色应为阴性。

⑷ DAB－H2O2底物染色对照，即不加酶抗体，只加DAB－H2O2液。以检查内源性酶被抑制的情况。

结果判定

在对照组成立的前提下，α－萘酚复染法：在细胞浆内酶标抗体抗原复合物呈黄褐色,内源性酶被染成红色,背景为浅棕色；单染法：在细胞浆内，酶标抗体抗原复合物呈黄褐色,背景成淡黄色或无色。

注意事项

1．标本必须新鲜，否则非特异性反应重。

2．固定剂的选择应以不影响抗原的活性又不妨碍抗体进入细胞为原则。病毒标本的固定剂一般选用冷甲醇和丙酮。

3．消除内源性酶的办法：

⑴ 以0.30％～3%H2O2液室温处理标本15min～30min；

⑵ 0.10%苯肼37℃处理1h；

⑶ 0.074%盐酸乙醇液(100ml乙醇含0.20ml浓盐酸)，室温处理15min。

4．消除背景染色的办法 背景染色可以是特异性的，因为细胞浆的外溢和炎性浸润造成。但大量的是非特异性的，主要是由于组织成分对免疫球蛋白的非特异性吸附所致，可以采用以下办法消除。

⑴ 切片以0.30％～3% H2O2作用后,再以10%卵蛋白作用30min。

⑵ 以0.05%吐温-20和含有0.10%牛血清白蛋白的PBS液预处理。

如果采用间接法测定抗原，则可采用下法来消除背景的染色。

⑶ 以与第一血清不同种类的正常动物血清做预处理。

⑷ 用来自于酶标记第二抗体的同种动物的血清做预处理,也可用这种血清来稀释第一抗体。

5．抗体浓度和酶标抗体浓度的确定 直接法测定的酶标抗体浓度是以不同梯度的稀释经过试验而定。间接法测定的第一抗体浓度和第二酶标抗体浓度的确定，则必须进行双方阵试验预以选择。抗体浓度和酶标抗体浓度的确定均不宜过高或过低。过高易出现非特异性反应，过低则影响检出的敏感性。