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高效毛细管电泳(HPLC)的基本原理

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-07-07   浏览次数:1397

高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是近年来发展起来的一种分离、分析技术,它是凝胶电泳技术的发展,是高效液相色谱分析的补充。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,HPLC分析高效、快速、微量。
电泳迁移
不同分子所带电荷性质、多少不同,形状、大小各异。一定电解质及PH的缓冲液或其它溶液内,受电场作用,样本中各组分按一定速度迁移,从而形成电泳。
电泳迁移速度(v)可用下式表示:
v=uE
其中E为电场强度(E=V/L,V为电压,L为毛细管总长度)。u为电泳淌度。
电渗迁移
电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。特殊结构的熔合硅毛细管管壁通常在水溶液中带负电荷,在电压作用下溶液整体向负极移动,形成电渗流。带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。
分离分析类型
根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型:①毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE);②毛细管等速电泳(capillary chromatography,CITP);③毛细管胶速电动色谱(miceller electrokinetic capillary chromatography,MECC);④毛细管凝胶电泳(capillary gelelectrophoresis,CGE);⑤毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing ,CIEF)。
毛细管区带电泳(CZE)为HPCE的基本操作模式,一般采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液,实验条件包括缓冲液浓度、pH值、电压、温度、改性剂(乙腈、甲醇等),用于对带电物质(药物、蛋白质、肽类等)分离分析,对于中性物质无法实现分离。毛细管胶束电动色谱(MECC)为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱,在缓冲液中加入离子型表面活性剂作为胶束剂,利用溶质分子在水相和胶束相分配的差异进行分离,拓宽了CZE的应用范围,适合于中性物质的分离,亦可区别手性化合物,可用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的分析。毛细管等速电泳(CITP)采用先导电解质和后继电解质,构成不连续缓冲体系,基于溶质的电泳淌度差异进行分离,常用于离子型物质(如有机酸),并因适用较大内径的毛细管而可用于微制备,但本法空间分辨率较差。毛细管等电聚焦电泳(CIEF)用于具兼性离子的样品(蛋白质、肽类),等电点仅差0.001可分离的物质。毛细管凝胶电泳(CGE)依据大分子物质的分子量大小进行分离,主要用于蛋白质、核苷酸片段的分离。此外,还有毛细管电色谱(CEC)及非水毛细管电泳(CNACE),用于水溶性差的物质和水中难进行反应的分析研究。目前CZE和MECC用得较多,本文以这两种方法为例来说明HPLC的原理。
CZE的基本原理
HPLC选用的毛细管一般内径约为50μm(20~200μm),外径为375μm,有效长度为50cm(7~100cm)。毛细管两端分别浸入两分开的缓冲液中,同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极,该电压使得分析样品沿毛细管迁移,当分离样品通过检测器时,可对样品进行分析处理。HPLC进样一般采用电动力学进样(低电压)或流体力学进样(压力或抽吸)两种方式。在毛细管电泳系统中,带电溶质在电场作用下发生定向迁移,其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗是指在高电压作用下,双电层中的水合阴离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象;电泳是指在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。溶质的迁移速度由其所带电荷数和分子量大小决定,另外还受缓冲液的组成、性质、pH值等多种因素影响。带正电荷的组份沿毛细管壁形成有机双层向负极移动,带负电荷的组分被分配至毛细管近中区域,在电场作用下向正极移动。与此同时,缓冲液的电渗流向负极移动,其作用超过电泳,最终导致带正电荷、中性电荷、负电荷的组份依次通过检测器。
MECC的基本原理
MECC是在CZE基础上使用表面活性剂来充当胶束相,以胶束增溶作为分配原理,溶质在水相、胶束相中的分配系数不同,在电场作用下,毛细管中溶液的电渗流和胶束的电泳,使胶束和水相有不同的迁移速度,同时待分离物质在水相和胶束相中被多次分配,在电渗流和这种分配过程的双重作用下得以分离。MECC是电泳技术与色谱法的结合,适合同时分离分析中性和带电的样品分子。

 
  
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