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饲料中霉菌毒素检测技术新进展

放大字体  缩小字体 发布日期:2010-04-22  浏览次数:454
核心提示:由于产生毒素的霉菌无处不在,以及我们对大多数有利于霉菌生长和霉菌毒素产生的条件控制不力,造成食品和饲料的霉菌毒素污染问题越来越成为现代农业生产中不可忽视的重大难题。在各种农产品上生长着的各种各样的霉菌,这些霉菌都能产生霉菌毒素,霉菌毒素是有毒的化合

    由于产生毒素的霉菌无处不在,以及我们对大多数有利于霉菌生长和霉菌毒素产生的条件控制不力,造成食品和饲料的霉菌毒素污染问题越来越成为现代农业生产中不可忽视的重大难题。在各种农产品上生长着的各种各样的霉菌,这些霉菌都能产生霉菌毒素,霉菌毒素是有毒的化合物,有些甚至是致癌的。霉菌毒素有很多种(CAST,2003),包括黄曲霉毒素,主要是黄曲霉毒素B1和M1(Aflatoxins,FB1、FM1);赭(棕)曲霉毒素A(OchratoxinA,OA);杂色(柄)曲霉毒素(Terigmatocystin);展青霉素(Patulin,PTL);玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN(F-2));串珠镰刀菌素(Moniliformin,MF),三硝基丙酸以及属于单端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)的T-2毒素(T-2toxin,T-2);脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)(Deoxynivalenol,DON);二乙酰镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol,DAS)等。

    联合国粮农组织在近期的报道中指出,全世界至少99个国家,占世界人口的87%,针对粮食和饲料的霉菌毒素污染问题都有相关的规定。在未来的几年里,与不断变化的全球气候有关的气象突发事件的增多将进一步向我们提出挑战。霉菌毒素污染给粮食生产者、 家禽生产者以及食品和饲料的加工企业造成了巨大的经济损失。

    一、饲料霉变对畜牧业的危害

    霉菌毒素污染的饲料对动物生产性能带来的负面影响有些是察觉不到的, 有些却是破坏性的。世界范围内,养殖业每年因霉菌毒素对饲料的污染造成的经济损失就有几百亿美元。黄曲霉毒素污染造成经济损失包括它能使动物生长受阻、 饲料适口性降低、食欲减退、饲料转化效率下降、死亡率增加、降低繁殖性能、蛋鸡产蛋量减少、 肉鸡腿病和胴体污染、内脏出血、肝脏受损、胚胎中毒和对环境应激和病原微生物的抵抗力下降等等。

    肉鸡黄曲霉毒素中毒后,血液中总蛋白、 胆固醇和血液尿素氮的含量减少。还发现黄曲霉毒素影响维生素D的代谢,造成骨骼强度下降,腿软弱无力。另外黄曲霉毒素还影响几种矿物元素的代谢,如铁(引起溶血性贫血)、 磷(引起腿软弱无力).

    霉菌毒素主要通过影响细胞和体液免疫功能来降低动物机体的抵抗力。大量研究表明,黄曲霉毒素引起肉鸡的免疫功能抑制进而增加对疾病的易感性,饲以蛋鸡50~200μg/kg黄曲霉毒素的日粮,其产蛋率和孵化率显着降低;对肉鸡的研究表明,日粮中100~200μg/kg的黄曲霉毒素可显着降低粘囊重量,对肉鸡免疫功能产生不良影响。当实验动物接触单端孢霉毒素后,会导致其对传染病的易感性。黄曲霉毒素对免疫系统的影响有如下几方面:法氏囊和胸腺的体积变小;T淋巴细胞、B淋巴细胞和白细胞的数量减少;血清总蛋白和免疫球蛋白水平降低;抗体滴度下降;血清中抗生素浓度下降等。单端孢霉毒素也可影响抗体的产生,这使得机体反应在免疫程序中减弱。赭曲霉毒素A对免疫功能有抑制作用。这和赭曲霉毒素的致癌作用有肯定的联系。

    霉菌及其代谢产物(主要是霉菌毒素)在动物性食品中残留可通过食物链而对人类健康构成潜在危害。黄曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素B1在哺乳动物体内的主要代谢产物。存在于动物的乳汁、肝、蛋类等可食部分,常见于乳汁中,它有很强的毒性和致癌性。由于乳及乳制品是婴幼儿的主食,而婴幼儿的解毒功能器官发育不完善,因此对婴幼儿健康有直接的威胁。赭曲霉毒素A在动物产品中的残留问题也已引起重视。Krogh等证实该毒素可在肾、肝和肌肉中残留。

    二、饲料中霉菌毒素的定性和定量检测

    随着环境的恶化,人民生活水平的提高,人们对饲料污染和食品安全的关注程度正在不断地加强。霉菌毒素作为影响饲料品质和人类健康的重要因素也逐渐明朗起来,对食品和饲料中霉菌毒素的定性和定量检测技术的出现为人畜的健康提供了有力保障。鉴于霉菌毒素独特的结构,寻找快速、高灵敏度、高特异性的霉菌毒素检测方法,显得尤为重要。根据最近几年的报道总结,一类是生物学检测法, 包括种子发芽试验、呕吐试验等,很不利于快速检测,已很少采用;一类是理化检测法, 薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC).TLC虽然简便,但灵敏度差; HPLC虽然灵敏度高,但样品处理烦琐,操作复杂,仪器昂贵,标准品耗用大。另一类是免疫化学检测法,如ELISA方法和胶体金免疫层析方法。

    2.1目测法

    当出现畜禽拒食,饲料和谷物发热,有轻度异味,色泽变暗,饲料结块等迹象时应考虑饲料可能霉变。因霉菌都是从霉菌孢子或是菌丝体碎片开始生长的,霉菌生长时消耗了养分,代谢中有能量释放,故而使饲料变色、变味、发热。

    菌丝体可与饲料纵横交织,形成菌丝蛛网状物,这些结构使得饲料结块。在我们肉眼所能够观察到这些菌丝网状物以前,菌丝体已经在大范围内生长繁殖。因此,饲料结块是诊断饲料霉变的最简易实用的方法之一。

    不同的霉菌菌落各有其特征,通过显微镜观察可进一步检测确认。

    1.2.1 曲霉属

    此属菌的菌落颜色多样,而且比较稳定,是分类的主要特征之一。曲霉菌落表面一般呈绒毛状,起初为白色或灰白色,长出孢子后则显现出不同的颜色,随菌种而异。如黄曲霉毒素产毒菌株长出黄绿色分生孢子,此时将培养皿置于365 nm紫外灯下,菌丝体出现亮紫色荧光。寄生曲霉由致密的基层菌丝组成,具有较宽、白色、几乎不形成孢子的边缘,前期呈明显的淡黄色,以后呈草绿色,最后呈暗浊黄绿色,其小梗是纯单层。杂色曲霉小梗严格双层,分生孢子头呈典型的放射状,明显的绿色,分生孢子梗无色或浅褐色。

    1.2.2 青霉属

    青霉的菌落大多呈灰绿色。菌落有绒状、絮状、绳状和束状4种类型。有的青霉菌菌落具有放射性皱褶,有的形成同心轮纹,有的在基质表面有渗出液。显微镜下观察时可见到独特的帚状体结构。

    1.2.3 镰刀菌属

    镰刀菌菌落一般呈白色绒毛状,常产生可溶性色素。分生孢子有大小2种类型,显微镜下大型分生孢子大多呈镰刀形,多隔;小型分生孢子有卵形、梨形、圆形和柱形等。

    2.2薄层层析法(TLC)

    TLC法是我国测定食品及饲料中霉菌毒素的国家标准方法之一,其原理是针对不同的样品,用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来,经柱层析净化,再在薄层板上层析展开、分离,利用霉菌毒素的荧光性,根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。TLC法由于设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用,但该法样品前处理繁琐,且提取和净化效果不够理想,提取液中杂质较多,在展开时影响斑点的荧光强度,而双向展开虽避免了杂质干扰,但增加了操作步骤和时间(叶雪珠,2003).

    2.3色谱法(HPLC)

    色谱法,包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱等,一直是最重要的真菌毒素的化学分析方法。薄层色谱由于方法灵敏度和分离效率等问题,1985年以后便很少用了,然而,在发现确证新毒素、快速监测方法建立、毒素分析方法研究等方面,尤其是当实验条件有限时,薄层色谱还是有其优越性的;气相色谱,包括气相色谱-质谱联用技术,更多的是用在单端孢霉烯族毒素的分析上;现在比较普遍的真菌毒素的分析方法还是液相色谱法,包括液相色谱-质谱联用技术,在方法适用性、分离效率和灵敏度方面,液相色谱法及液相色谱-质谱联用技术都是其他方法所无法替代的。近年来,毛细管电泳及毛细管电泳-质谱联用技术以其高分离效率也开始应用在真菌毒素分析领域并引起了广泛关注。

    总之,HPLC法是近几年发展起来的检测霉菌毒素方法,主要是用荧光检测器检测,在适宜的流动相条件下,采用反相C18柱,使霉菌毒素同时分离。该法快速而准确, 纯化效果好,最低检出量0.08ng,回收率为92.87%,但需要昂贵的仪器设备,仅限于专业检测机构获得科研和调查分析、监测使用,未能在企业广泛推广使用,而且其结果的滞后效应大大降低了对生产实际的指导效果。

    2.4免疫化学检测法

    免疫学检测方法是基于抗体与抗原或半抗原之间的选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法。通常具有高的选择性和很低的检出限,广泛用于各种抗原、半抗或抗体的测定,一般可分为荧光免疫法、发光免疫法、免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法,其中在饲料霉菌毒素检测中应用较广的主要是酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析方法。ELISA 法特别适宜大批样品集中检测,胶体金免疫层析方法适合现场单个或少数样品即时检测。

    1977年美国Lawell 等首先建立了ELISA竞争法检测AFB1 .随后美国学者朱繁生教授、英国学者Morgan 教授分别改进了该法。我国李秀芳和俞顺章教授分别于1987年与90 年代建立了ELISA 法检测AFB1 ,成恒嵩教授等起草了饲料中AFB1 的ELISA检测方法国家标准,并于1998 年由国家质量技术监督局正式批准颁布实施。

    免疫学检测方法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备,且对样品纯度要求不高等特性,特别适用于饲料厂进行原料或成品的检测。其基本原理是在合适的载体上,酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原抗体复合物,在酶底物参与下,复合物上的酶催化底物使其水解,氧化或还原成为另一种带色物的抗原和抗体的含量。该免疫学方法更实际,其灵敏度与TLC或HPLC法相当,因而具有更广阔的应用前景。

    该类方法有以下特点:1) 灵敏度高:免疫层析法可检出量可达ng级,ELISA 法最低检出量可达pg级,并可定量测定。2) 干扰小:抗体抗原的免疫反应特异性很强,结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。3) 操作简便快捷:由于特异性强,简化了样品的预处理和提取纯化过程,同时操作步骤也非常简便,测定时间也短。4) 安全性高,污染少,成本低廉:不需要昂贵的测定仪器,所用试剂也相对较少,特别是因为灵敏度高,毒素标准品的浓度可以很低,减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。

    三、国内几种真菌毒素检测方法的研究进展

    3.1 黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个  氧杂萘邻酮(香豆素).前者为基本毒性结构,后者与致癌有关。国内最早研究真菌毒素免疫检测方法的是中国医学科学院肿瘤研究所的孙宗棠,他于1983年建立了AFB1单克隆抗体放射免疫测定方法。1992年,中国科学院上海细胞所李永镛和上海医科大学公共卫生学院殷芬、俞顺章等人合作建立了AFB1单克隆抗体的酶联免疫检测方法。中国预防医科院营养与食品卫生研究所和江苏微生物所也先后建立了AFB1多克隆抗体的酶联免疫测定方法。北京市营养源研究所路戈与中国医科院肿瘤研究所王德斌和卫生部食品卫生监督检验所计融等人合作于1994年建立了规范的AFB1单克隆抗体酶联免疫检测方法,该法已列为国家标准(GB/T5009.22-1996).在1985年以前,另有几种荧光色谱法列为国家标准(GB/T5009.23-1996;GB/T5009.24-1996).其中薄层色谱法由卫生研究所和青岛商品检验局于1973年建立(GB/T5009.22-1996).

    3.2 T-2毒素为剧毒(猪静注LD50=1.2mg/kg),具有明显的细胞毒,而且是体内蛋白质合成的抑制剂,有致畸性和致突变性。中毒后呕吐,腹泻,严重时损伤造血组织。T-2毒素的免疫检测方法由卫生部食检所阳传和、罗雪云、计融于1991年建立(GB/T14933-94),方法最低检出量为1ng/ml,敏感范围为4-1000ng/ml.这是首次采用免疫技术建立的检测真菌毒素的国家标准。

    3.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素,DON)是较早(1970年)被分离提纯后命名的真菌毒素,毒性弱于T-2毒素,(小鼠经口LD50=9.2mg/kg)中毒症状类似,有明显的致吐作用。DON经对甲基苯甲醛喷雾后呈黄色,卫生部食检所魏润蕴于1986年建立了DON薄层层析检测方法(GB/T14929.5-1994).DON免疫检测方法由卫生部食检所阳传和、计融于1992年建立,方法最低检出量为5ng/ml,敏感范围为5-1000ng/ml,该法已批准为国家标准(GB/T14929.5-1994).小麦、面粉、玉米及玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准已于1996年9月1日颁布实施(GB16329-1996),最高允许量1000μg/kg .

    3.4二乙酰镳草镰刀菌烯醇(DAS)的毒性强于T-2毒素(猪静注LD50=0.367mg/kg),1992年,卫生部食检所李业鹏、罗雪云等用酶标记单克隆抗体建立了检测DAS的双抗夹心酶免疫斑点检验方法,最低检出量为10ng/ml,敏感范围为2-1000ng/ml.

    3.5玉米赤霉烯酮(ZEN,F-2)是另外一种从赤霉病麦中分离出来的真菌毒素(化学名称为6-(10-羟基-6-氧基碳烯基)-β-雷锁酸-μ-内酯,分子量为318),主要污染小麦、大米、玉米、荞麦等谷物,是一种生殖系统毒素,有强烈致畸作用。ZEN在波长为254nm短紫外光照射下发出兰绿色荧光,卫生部食检所罗雪云、胡霞于1992年建立ZEN薄层层析分析方法,最低检出量为50μg/kg.1993年中国农科院兰州兽医所王景琳、张志东等建立了ZEN单克隆抗体酶联免疫检测方法,最低检出量为0.3ng/ml.1995年,北京市营养源研究所路戈等也建立了ZEN单克隆抗体免疫检测方法,最低检出量为1ng/ml,敏感范围5-1000ng/ml,该法已通过国家标准审查。

    3.6 赭曲霉毒素A(OA)主要表现为很强的肾脏毒(大鼠经口LD50=20mg/kg)并有致畸性和致癌性,污染的谷物主要为麦类及玉米。在紫外光下赭曲霉毒素A呈绿色荧光,卫生部食检所于1991年建立了OA薄层层析分析方法,已列入国家标准(GB13111-91).1992年该所阳传和、罗雪云等又建立了OA单克隆抗体免疫检测方法,也已经被批准为国家标准。

    3.7 黄曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1经动物代谢产生的衍生物,可以从内脏、尿和乳汁中测出。尿或乳汁中排出的AFM1的量约为摄入AFB1量的1%.AFM1的毒性(鸭雏经口LD50≈0.32mg/kg)仅次于AFB1,致癌性也相似。因此乳及乳制品中AFM1的污染控制是食品卫生工作的重要环节。我国规定牛乳中AFM1的含量不得超过0.5μg/kg,乳制品按实际含乳量折算(GB9676-88).1980年卫生研究所胡文娟、韩玉莲(AFM1在波长365nm紫外光照射下呈兰紫色荧光)建立了检测几种主要动物性食品中AFM1的薄层层析法,最低检出量为0.1~0.5μg/kg(GB/T5009.24-1996).1992年中国预防医科院营养与食品卫生研究所的刘兴介等人利用美国威斯康星大学朱繁生教授提供的单克隆抗体应用ELISA直接竞争法测定了97份乳粉样品中的AFM1含量。(阳性率84.5%,超标率39.2%,最高4.16ng/g)1996年,卫生部食检所李燕俊、计融开始研究AFM1的免疫检测技术,目前主要工作已经完成。

    3.8杂色曲霉素(柄曲霉素,分子量324)是一种很强的肝及肾脏毒素。可导致胆管癌和肝癌,有致突变性,但对食品的污染频率较低。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热,可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准(GB/T5009.25-1996).该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25μg/kg,黄豆、花生为50μg/kg.

    3.9展青霉素(PTL)有致癌性,也有致畸、致突变作用,在水果制品中的污染较为严重。1998年卫生研究所刘勇、胡文娟建立了苹果、山楂制品中展青霉素的薄层扫描测定法。该法于1994年列为国家标准,同时还规定了展青霉素的限量卫生标准(GB14974-94).1992年吴南建立了用高效液相色谱法测定展青霉素的方法,最低检出量为2μg/kg.

    3.10串珠镰刀菌素(MF)属剧毒物,有很强的心脏毒,中毒死亡后可见心肌坏死性病变,近年研究表明该毒素可能是克山病主因。串珠镰刀菌广泛污染粮食作物,其中对玉米的污染率较高。1984年,俞世荣、王玉华建立了串珠镰刀菌素的薄层及高效液相色谱测定法。

    四、小结与展望

    因化学加工、人为添加而引入食品中的有毒化合物所造成的危害是可以被预防的;而以食品的天然组分形式存在的天然霉菌毒素则不易被识别,且由于潜在毒性大,从而会对消费者的健康造成很大的威胁。霉菌毒素是霉菌次级代谢产物,属于化学污染物,对人和动物都会产生非常严重的危害。拿黄曲霉毒素来说,含有黄曲霉毒素的食品被人误食后容易出现肝脏病变,甚至导致肝癌;所以,霉菌毒素检测是非常迫切需要解决的问题。

    可以说,越早进行霉菌毒素检测就越容易将霉菌毒素产生的危害降到最低。如能从源头就发现霉菌毒素,则更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素,以免受霉菌毒素污染的饲料给养殖业带来危害,从而使企业包括食品安全蒙上阴影。实际操作中,如果在饲料原料采购环节就采用快速筛选的方法,查看饲料原料是否含有霉菌毒素,则可以使企业避免使用含霉菌毒素的原料生产饲料,或者在原料紧缺又必须生产的情况下,可以针对检测结果采取有效的霉菌毒素处理技术,全面降低霉菌毒素的毒害性。

    所以,研制对霉菌毒素快速、高灵敏、高特异性的检测方法显得尤为重要。高效液相色谱、质谱检测法,可做出精确定性定量测定,运用恰当甚至可测到各组分的含量,它们灵敏度高、选择性强,有极好的发展前景,但是样品前处理要求严格,标准品纯度有一定的要求,而且仪器昂贵,测试人员往往还要进行专门的培训,因此成本较高。所以,仅适合大型企业或对检测灵敏度要求较高的科研院校、检测机构等单位使用。免疫学检测方法尤其是酶联免疫吸附法具有灵敏度高,干扰少,测定步骤简便、快速,操作安全,设备投资少,测定结果准确可靠等特点。所以,免疫分析法仍常常作为一些单位的首选,但是往往一次性需要较多的样品,单一样品处理在经济上是不合算的。在传统检测方法基础之上,近年来发展了许多新的检测方法,其中值得一提的是,最近建立的基于基因工程单链抗体(scFv)竞争ELISA检测方法,相比传统方法,具有很多优势:首先,基因工程单链抗体(scFv)可以在大肠杆菌中快速、大量地得到表达,而常规地ELISA使用的单克隆抗体要利用杂交瘤技术生产,费时、费力、成本高。其次,基因工程单链抗体基因容易和其他小分子如报告基因融合,形成融合蛋白以用于检测或其它用途。另外,霉菌毒素快速检测试纸法应用于饲料原料检测,可以快速得到结果,为饲料、养殖企业应对霉菌毒素潜在危害的处理提供直接的、事先的、相对合理的科学依据。当原料快检呈阳性结果时表明样品中毒素的残留限量在限值以上,与目前市售的试剂盒相比,具有快速、方便、便宜和现场性等特点,加上其成本只有进口同类产品的40%左右,完全可以替代进口产品。

 
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