[1] 前言
MagExtractor -Plasmid-利用在Chaotrpic（盐）试剂存在的情况下，核酸能吸附在硅胶表面的特性，进行plasmid DNA的抽提·纯化。磁性体使用的是封入的磁珠，所以能够利用永久磁石很容易地分离回收核酸。磁珠依据吸附条件，分别对蛋白质，DNA，RNA等不同物质具有不同的吸附能力，所以能够简便地纯化核酸。本试剂盒除了作为用于全自动核酸抽提装置MFX-2000的试剂外，也可以作为手动抽提试剂盒来使用。
性能·特征
·能够从大肠菌中抽提·纯化出plasmid DNA
·能够回收3～6μg的plasmid DNA（50～150ng/μl）*1，可用于转化，限制酶处理，DNA 测序反应等。
·能在10～15min之内抽提出plasmid DNA。
·不使用苯酚、氯仿等危险溶液。
·无需乙醇沉淀。
[2] 使用前须知
1）注意
MagExtractor -Plasmid-准备了四种对应于MFX-2000，二种对应于手动的操作程序。使用对磁珠不进行干燥处理的操作程序（手动操作程序Ⅰ以及MFX-2000的”Speedy”和”Lowcost”等操作程序）所得到的回收液，需要注意以下几点。
·对于限制酶及转化处理，可直接加以使用。
·琼脂糖电泳时的Loading Dye必须使用本试剂盒附带的产品。使
用一般的产品组分时，可能样品会无法沉淀。
·当用于DNA测序时的模板时，乙醇会阻碍测序反应，可将回收液置于1.5ml试管内，保持试管打开状态加温至78℃ 40min。（也可只加温处理必要的剂量。参考13页。）
·为了不让乙醇混入回收液中，请使用手动操作程序Ⅱ（参
考12～13页），如果是MFX-2000的场合下，请使用”Dryup”
或”Fullauto”等操作程序。
*1 从M109/pUC19过夜培养液中进行抽提的场合。
[3] 试剂盒中所包含的物品
本试剂盒中含有能够进行500次plasmid DNA回收的试剂量。
130 x 2ml........ 吸附液（含有蛋白质变性剂）............................................ 4℃或者室温下保存
16ml........ 磁珠Ⅰ............................................................................. 4℃或者室温下保存
16ml........ 磁珠Ⅱ............................................................................. 4℃或者室温下保存
80ml........ 再悬浮液....................................................................................... 4℃下保存
80ml........ 溶解液Ⅰ（含有蛋白质变性剂）........................................ 4℃或者室温下保存
20ml........ 溶解液Ⅱ（含有蛋白质变性剂）...................................................... 4℃下保存
65ml........ 中和液............................................................................. 4℃或者室温下保存
60ml........ 溶出液.......................................................................................... 4℃下保存
11ml........ 5 x Loading Dye........................................................................... 4℃下保存
·试剂如果沾在手或衣服上或使用后，请彻底用清水清洗。万一不慎进入眼睛，立刻
用清水彻底清洗，然后去看医生。
·溶解液Ⅰ有时会产生析出物。请在室温～40℃下完全溶解后再使用。
·溶解液Ⅰ，Ⅱ的混合液在室温下保存超过三个星期后请不要再使用。*1溶解液Ⅰ，Ⅱ以外的试
剂请在4℃下保存。
·使用本公司的核酸自动抽提装置MFX-2000的情况下，请在指定的瓶中注入必要的剂量，置于指定部位。详细方法请参考MFX-2000的使用说明书。
[4] 操作程序
1．试剂盒以外所需要的其他物品
（1）试剂
·灭菌水（蒸馏水或者milliQ水经过高温高压湿热灭菌）
·乙醇溶液（99.5％以上的特级品，使用手动法的时候用70％
的乙醇溶液）
（2）器具·器材
·微量移液器
·微量移液器用的tip头
使用MFX-2000的场合，必须配备以下物品。
·抽提专用试管（Code No：MFX-301）
·抽提专用6连试管（Code No：MFX-302）
·附带专用过滤器的tip头（Code No：MFX-402）
*1 有时plasmid DNA的回收量及纯度会发生降低。
·试剂设置用试管（50ml用，15ml用，2ml用*1）
使用手动法的场合，必须配备以下物品
·1.5ml小型试管用的磁性台架（商店有售）
·漩涡混合器或者小型试管混合器
·简易台式离心机（12,000r.p.m.）
2．抽提流程
MagExtractor -Plasmid-通过以下五个工序对Plasmid DNA进行抽提和纯化。
①集菌
②碱溶菌
③中和
④通过磁珠Ⅰ去除菌体残渣
⑤通过磁珠Ⅱ分解，纯化Plasmid DNA
使用MagExtractor -Plasmid-和MFX-2000时，上述的②～⑤可成为自动化操作。
3．宿主菌的培养
培养含Plasmid DNA的大肠杆菌。培养基可使用和通过LB，TB等碱性SDS法等方法来抽提Plasmid DNA的时候同样的培养基。由于Plasmid的回收量受拷贝数量以及菌体数量影响，推荐使用使MagExtractor -Plasmid-能够使回收量更加稳定的MMI培养基。使用MMI培养基的情况下，菌体量和TB的情况等同（JM109 / pUC18，50μg / ml氨苄青霉素9～11O.D.）。
MMI培养基的配制方法
|←蒸馏水800ml
|←13g Bacto trypton
|←25g Bacto yeast extract
|←8.5g NaCl
|←4ml 丙三醇
|←20ml 1M Tris-HCI，pH7.2
| 加蒸馏水到1000ml
| 高温高压湿热灭菌
*1 50ml，15ml试管请使用BECTON DICKINSON公司生产的BLUE MAX
2170,BLUE MAX 2196,2m试管请使用本公司生产的NO.72.693。
4．集菌
使用MagExtractor -Plasmid-能够处理的菌体量在手动法时是12～13O.D.，使用MFX-2000时是5～9 O.D.。根据菌体量和抽提方法的不同所引起的回收量的不同可以参考下图所示。在使用MFX-2000处理10 O.D.以上的剂量时，有可能会无法进行充分的搅拌（pipetting），使得纯度下降，请务必注意。使用angle rotor对1.5ml试管进行集菌时，菌体量请按照图2所示为标准。
·请将培养液置于1.5ml试管中。
·请用12,000rpm离心分离2min。
·请仔细去除上清部分。
菌体量（O.D.）
图1：菌体量的不同引起的回收量的变化（JM109 / pUC18，MMI培养液）
过少 适量 过多
图2：菌体量的标准
5．试剂的制备
·溶解液
请按照4:1（v:v）的比例对试剂盒中的溶解液Ⅰ*1，Ⅱ进行混合。请将此混合液在室温下保存，三周后请勿继续使用*2。通过手动法抽提的时候需要150μg / 样品。使用MFX-2000的时候，请参考第九页的表【各试剂的使用剂量标准】进行制备。
·70％乙醇溶液
只有在使用手动法的时候使用。需要1500μg / 样品。
6．使用MFX-2000抽提Plasmid DNA的方法
在使用MFX-2000前，请务必阅读MFX-2000的使用说明书。使用抽提程序中的”Dryup”或”Fullauto”程序时，需要有加温的功能*3。请使用标准式样（加温，简易保温功能 / Code No.：MFX-102）或者是特殊式样（加温，电子冷却功能 / Code No：MFX-103）。
（1）操作程序的选择
MFX-2000中准备了4种可供抽提Plasmid DNA用的操作程序。选择其中一个，将其号码输入在液晶画面中。
·一次操作只能选择其中一个操作程序。
·下表的抽提时间不包含分装时间。实际的抽提时间根据样品不同
会有所变化，以下表的抽提时间 x 样品数 x 1.25（小时）为标准。
|
号码
|
液晶画面的第3行显示的内容
|
样品
|
抽提
时间
|
用途*1
|
|
A
|
B
|
|
31
|
[Plasmid： Speedy]
|
再次悬浊液
|
10min
|
○
|
∆*2
|
|
32
|
[Plasmid： Dryup]
|
再次悬浊液
|
15min
|
○
|
○
|
|
33
|
[Plasmid： Fullauto]
|
集菌后的菌体
|
16min
|
○
|
○
|
|
34
|
[Plasmid： Lowcost]
|
菌体抽提液
|
6min
|
○
|
∆
|
*1 用途A：用于限制酶处理，转化
用途B：DNA 测序，或使用回收液超过50％时的反应。
*2 通过手动法进行去除乙醇的操作后便可以进行DNA 测序。
*1 有析出物的场合，请在室温～40℃中彻底溶解。
*2 Plasmid DNA的回收量和纯度有时会降低。
*3 如果只使用”Dryup”或”Fullauto”操作程序，请使用基本样式的
MFX-2000（简易保温功能 / Code：MFX-101）。
·操作程序 “31：Speed”
适用于限制酶处理以及转化用Plasmid DNA的制备。将再次悬浊液置于MFX-2000中，大约在10min / 样品下抽提出Plasmid。
·操作程序 “32：Dryup” “33：Fullauto”
适用于DNA 测序用Plasmid DNA的制备。处理较多菌体（7～9O.D.）时适合使用针对再次悬浊液的 “32：Dryup”，处理较少菌
时（5～6O.D.）时适合使用针对集菌后的菌体的“33：Fullauto”。
·操作程序 “34：Lowcost”
使用通过以下的操作设置处理过的样品。由于仅使用专用试管1个/样品（其他操作程序时3～4个），故能够以较低成本回收Plasmid DNA，
并能够在6min / 样品下实现限制酶处理，以及转化用的Plasmid DNA的制备。
集菌后的菌体
|←150μl再次悬浮液
| 用漩涡混合器搅拌60sec
|←150μl溶解液（溶解液Ⅰ，Ⅱ按4：1（v：v）的比例混合后的溶液）
| 反复颠倒试管5次以实现搅拌
| 放置于冰上5min
|←120μl中和液
| 反复颠倒试管5次以实现搅拌
| 放置于冰上5min
| 12,000rpm，10min
设定MFX-2000
（2）加温block，回收block的温度设定*1
|
|
加温block
|
冷却block
|
|
温度设定
|
78℃
|
10℃
|
·简易冷却时，冷却block应事先在冷藏库或者冷冻库内冷却。
（3）附带专用过滤器的tip头设置
·请使用附带专用过滤器的tip头（Code No：MFX-402）
·tip已通过γ射线灭菌。戴上手套将需要量专用tip安装在tip架中。
·关于tip的安装位置请阅读MFX-2000的使用说明书。
*1 设定方法请阅读MFX-2000的使用说明书。
·将需要量专用tip安装在tip架中。
|
|
tip数
|
|
tip数
|
|
操作程序号
|
31
|
32
|
33
|
34
|
操作程序号
|
31
|
32
|
33
|
34
|
|
样品数
|
1
|
10
|
11
|
11
|
5
|
样品数
|
13
|
61
|
74
|
74
|
26
|
|
2
|
13
|
15
|
15
|
6
|
14
|
64
|
78
|
78
|
27
|
|
3
|
16
|
19
|
19
|
7
|
15
|
67
|
82
|
82
|
28
|
|
4
|
19
|
23
|
23
|
8
|
16
|
70
|
86
|
86
|
29
|
|
5
|
27
|
32
|
32
|
12
|
17
|
78
|
95
|
95
|
33
|
|
6
|
30
|
36
|
36
|
13
|
18
|
81
|
99
|
99
|
34
|
|
7
|
33
|
40
|
40
|
14
|
19
|
84
|
103
|
103
|
35
|
|
8
|
36
|
44
|
44
|
15
|
20
|
87
|
107
|
107
|
36
|
|
9
|
44
|
53
|
53
|
19
|
21
|
95
|
116
|
116
|
40
|
|
10
|
47
|
57
|
57
|
20
|
22
|
98
|
120
|
120
|
41
|
|
11
|
50
|
61
|
61
|
21
|
23
|
101
|
124
|
124
|
42
|
|
12
|
53
|
65
|
65
|
22
|
24
|
104
|
128
|
128
|
43
|
（4）专用试管的设置
·请将专用试管设置在抽提架中。摆放位置根据操作程序的不同
而有所差异，请按照下表放置试管。
|
操作程序号
|
摆放场所
|
|
31～33
|
A. B. C. D. E. F
|
|
34
|
A. B. C. D
|
·请对加温block（只限于操作程序32，33），回收block设置所需样品数。
·对抽提架的A～F以及加温block，请勿使用专用试管以外的其他
试管。否则有可能会产生故障。
·对于回收block，请使用Assist公司的No.72.730试管。*1
*1 对于回收block，除了MFX-2000专用试管外，带螺旋式盖的1.5ml试管Assist试管No.72.692等也能使用。由于回收液中会有不同程度的磁珠残留，回收液超过50％的场合下，请对这些试管进行12,000rpm×2min的离心操作（如果回收液在反应液中的比例小于50％则不会存在问题。）
（5）试剂的设置
·本试剂盒内不含有灭菌水和乙醇溶液（99.5％以上的特级品），请
自己准备。
·请准备50ml容量试管FALCON 2170，15ml容量试管FALCON
2196，2ml容量试管Assist试管No.72.694。*1
·根据样品数的不同所需的试剂量也会不同。请根据第九页的表，在
指定试管内注入所需试剂的必要剂量。
·注入试剂时请以试管上的刻度为标准。
·视操作程序，有可能不需要安装某些试剂。
·将各试管放置在试剂架中。请将磁珠Ⅰ，Ⅱ再次摇匀，放置
在试剂架处。磁珠设置好后，请立刻启动装置（10分钟以内）。
（否则将产生回收量参差不齐及操作故障。）
·抽提后剩下的试剂可以再次使用（可追加减去的量并设置在MFX－2000上）。如果不再接下去使用，请将盖子盖好保存。如果长时间处于盖子打开状态，液体的组成成分有可能会起变化。
·使用的剂量请不要超过第九页表中记载的规定剂量。这是造成试管
塞污染以及液体溢出的原因。
【样品数在1～12时的试剂使用剂量】
|
试剂名
|
试管容量
|
分装量（ml）
|
设置
位置
|
|
操作程序号
|
|
31
|
32
|
33
|
34
|
|
吸附液
|
50ml
|
25
|
25
|
25
|
25
|
1
|
|
灭菌水
|
