VIP标识 上网做生意,首选VIP会员| 设为首页| 加入桌面| | 手机版| RSS订阅
食品伙伴网,关注食品安全,探讨食品技术
 

甲醇酵母表达系统

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-06-28  浏览次数:487

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母,主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种,其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛[1]。与以往的基因表达系统相比,它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。
1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达
目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功,包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一,但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10~100倍[2]。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L,而在甲醇酵母中为450mg/L,提高了60倍[3]。椐报道,外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L[9]。

表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生

外源蛋白质 产生量(g/L) 文献
转化酶 2.3 [4]
D-丙氨酸羧肽酶 0.8 [5]
α-淀粉酶 2.5 [6]
Kunitz蛋白酶抑制剂(AbPP) 1.0 [7]
瞬时抗凝蛋白(TAP) 1.7 [8]
破伤风毒素片段C 12.0 [9]
百日咳抗原P69 3.0 [10]
人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 1.3 [11]
肿瘤坏死因子(TNF) 10.0 [12]
人转铁蛋白N端 4.0 [13]

2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素
2.1 表达载体 首先,甲醇酵母中没有稳定的质粒,所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子,醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%[2],所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次,在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体,一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷,另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解,pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外,使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体,形成多个表达单元,产生高产的菌株,此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时,甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时,诱导基因表达,使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件,细胞干重达100g/L以上,蛋白质产量极高[14]。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型,从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。?

3. 应用前景
经过近几年的发展完善,甲醇酵母表达系统已日趋成熟,应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒,如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等,利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入,它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。

表2 国内利用甲醇酵母产生的外源蛋白质

外源蛋白质 产生量(g/L) 文献
人胰岛素 0.25 [15]
人胰岛素原 0.3 [16]
人p53蛋白 0.2 [17]
辣根过氧化物酶 4~6 [18]
人基质金属蛋白酶-9 0.01 [19]

[1]李黄金等. 《生物工程学报》,1998,14(4):337
[2]戴秀玉. 《微生物学报》,1997,37(6):483--485
[3]彭毅等. 《生物技术通报》,2000,(1):38
[4]Tschopp JF. Bio/Technology,1987,5:1305-1308
[5]Despreaux CW et al. Gene,1993,131:35--41
[6]Paifer E et al. Yeast,1994,10:1415--1419
[7]Wagner SL et al. Biochem Biophys Res Commun,1992,186:1138--1145
[8]Laroche Y et al. Bio/Technology,1994,12:1119--1124
[9]Clare JJ et al. Bio/Technology,1991,9:455--460
[10]Romanos MA et al. Vaccine,1991,9:901--906
[11]Scorer CA et al. Gene,1993,136:111--119
[12]Sreekrishna K et al. Biochemistry,1989,28:4117--4125
[13]Cregg JM et al. Bio/Technology,1993,11:905--910
[14]柴清等.《生命的化学》,1997,17(4):36
[15]王燕等.《生物化学与生物物理学报》,1999,15(3):587--589
[16]郭永志等.《生物工程进展》,1999,19(6):64
[17]邱荣德等.《生物工程学报》,1999,15(4):477
[18]蒋太交等.《生物化学与生物物理进展》,1999,26(6):584
[19]颜红春等.《中国生物化学与分子生物学学报》,2000,16(2):194

 

 
[ 网刊订阅 ]  [ 食品专题搜索 ]  [ ]  [ 告诉好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 关闭窗口 ] [ 返回顶部 ]

 
0条 [查看全部]  相关评论

 
推荐图文
推荐食品专题
点击排行