（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
（2）取反应物点样，观察酶切效果。
（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。
（4）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
（5）15000rpm离心15min，弃上清。
（6）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（7）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
（8）测定DNA的含量。
（9）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（10）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
