1．总RNA的提取（Northern 杂交）
2．第一链合成：
(1)总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。
(2)混匀后稍离心。
(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。
(4）准备dNTP mix (以5管为例 )
每管 5管
5×第一链缓冲液 2μl 10μl
dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl
MMLV逆转录酶（200u/μl） 1μl 5μl
5μl 25μl
(5）每管加入5μl，混匀后稍离心。
(6）42℃孵育1hr。
(7）75℃ 10min终止反应后置冰上，稍离心。
(8)将2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。
(9) 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。
(10)将72μl ddH2O分别加入A管中，混匀。
(11）将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。
3．dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明
（0.5ml PCR管,1代表对照组,2代表实验组）
管号 cDNA样品 引物
(1) 1A P1,T9
(2) 1B P1,T9
(3) 2A P1,T9
(4) 2B P1,T9
(5) H2O P1,T9
(6) RNA1 P1,T9
(7) RNA2 P1,T9
以下为阳性对照反应体系
(8) PC 1A P10,T8
(9) PC 1B P10,T8
(10) PC 2A P10,T8
(11) PC 2B P10,T8
(12) H2O P10,T8
(13) PC RNA1 P10,T8
(14) PC RNA2 P10,T8
在PCR 管中加入:
① cDNA样品 1μl
P引物 1μl
T 引物 1μl
② 准备其它 PCR试剂的混合液: (在另一管中加入)
成分 每管(μl) 所需管数( n=14)
10×buffer 2.0 2n
ddH2O 14.0 14n
dNTPmix 0.2 0.2n
α-32P dATP 0.4 0.4n
Taq酶 0.4 0.4n
终体积 17.0 17 n
混匀后稍离心。
③ 将17μlPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20μl。
④ 开始PCR扩增。
⑤ PCR循环参数：
在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序：
94℃ 5min
1 cycles 40℃ 5min
68℃ 5min
94℃ 30sec
2 cycles 40℃ 30sec
68℃ 5min
94℃ 20sec
23 cycles 40℃ 30sec
68℃ 2min
1 cycles 68℃ 7 min。
⑥ 反应结束后置-20℃保存备用。
4．电泳和放射自显影
(1）配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。
(2）预电泳30min。
(3）每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中，加5μl loading
buffer，混匀，离心，置94℃变性2min。立即置冰浴。
(4)停止预电泳，冲洗加样孔。
(5)加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
(6）下胶：（同测序胶）
(7）干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80℃干胶30min。
(8)X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。
图2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片
5．差异条带回收再扩增
(1）X光片经D72显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。
(1) 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，离心取上清为模板。
(3) 以原引物扩增：
回收DNA 7 μl
10×PCR buffer 5 μl
5mM dNTPmix 0.5 μl
引物P 2.5 μl
引物T 2.5 μl
Taq酶 2 μl
加ddH2O至总体积为50μl
(4) 执行PCR程序:
93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循环；68℃5min。
(5) 取PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。
(6) PCR产物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。
6．以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。
7．PCR产物的TA克隆。
8．DNA序列测定。
9．检索分析。
