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PCR | 反应五大要素

放大字体  缩小字体 发布日期:2024-01-08
核心提示: PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。 01引物 引物是PCR特异性反应的关键,
 PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

 

01引物

 

引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

 

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为宜。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

 

02酶及其浓度

 

目前有两种Taq DNA聚合酶,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

 

03dNTP的质量与浓度 

 

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris-HCL缓冲液将其pH值调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。

PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)。当其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

 

04模板(靶基因)核酸 

 

模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理样本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;

蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

 

05Mg2+浓度 

 

Mg2+PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增;浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

 

编辑:songjiajie2010

 
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