一、简介

本试剂盒是应用ELISA研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点,操作时间仅需55分钟，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、试验原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。

三、适用范围

可定性、定量检测动物组织（肌肉、肝脏等）卡那霉素的残留量。

四、交叉反应率

卡那霉素…………………………………………………100%

链霉素……………………………………………………〈1%

双氢链霉素………………………………………………〈1%

新霉素……………………………………………………… 〈1%

五、使用单位需自备的设备及试剂

设备：

┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm

┅┅均质器

┅┅电热恒温水浴锅

┅┅振荡器

┅┅涡旋仪

┅┅离心机

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶：500ml

┅┅聚苯乙烯离心管：2ml、50ml

┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、200ml～1000ml

多道 250ml

试剂

 

----十二水合磷酸氢二钠(分析纯)

----氯化钠(分析纯)

----氢氧化钠(分析纯)

----二水合磷酸二氢钾(分析纯)

----氯化钾(分析纯)

----去离子水

六、提供的材料与试剂

1、 96孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）

2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb

3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 1ppm

4、酶标二抗       7ml ……………………………… 红色帽

5、抗体工作液     10ml ………………………………绿色帽

6、底物液 A液   7ml ………………………………白色帽

7、底物液 B液    7ml ………………………………红色帽

8、终止液         7ml ……………………………… 黄色帽

9、 20×浓缩洗涤液 40ml …………………………… 透明帽

10、2×浓缩复溶液   50ml ………………………………蓝色帽

七、溶液的配制

配液1: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)

            称取13.4g十二水合磷酸氢二钠.20g氯化钠.0.32g氢氧化钠.0.5g二水合磷酸二氢钾.0.5g氯化钾加去离子水溶解定溶至500ml。

配液2: 洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。

配液3: 复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水），用于提取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。

八、样本前处理步骤

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

（c）未处理的样本冷冻保存。

（d）处理好的样本保存不可超过12h，应及时用于分析检测。

鸡肉＼猪肉、鸡肝＼猪肝样本前处理方法

----称取2.0±0.05g去除脂肪的粉碎样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml 0.1M PBS (PH=10~11)缓冲液（见配液1），混匀10min；

----放入60℃水浴环境中60min，取出水浴冷却至室温并摇匀；

----3000g以上，室温离心10min；

----移取上清液，加入复溶工作液（见配液3），以1：4的体积比进行稀释（100ml上清液+400 ml复溶工作液）；

----取50ml用于分析。

九、检测步骤

测定前应须知：

1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

操作步骤：

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml 到对应的微孔中，加入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液2）250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中避光反应15min（请参照注意事项8）。

8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。

十、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含卡那霉素成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.512，样本2的吸光度值为0.899，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.950；0.5ppb为1.550；1.5ppb为1.200；4.5ppb为0.650；13.5ppb为0.301； 40.5ppb为0.110。则样本1的浓度范围是4.5ppb-13.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中卡那霉素残留的浓度范围；样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中卡那霉素残留的浓度范围。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

样本的稀释倍数：

肌肉、肝脏样品的稀释倍数：20

十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度：0.5ppb

样本最低检测限：

鸡肉/肝,猪肉/肝…………………………………………… 10ppb

准确度：

鸡肉/肝,猪肉/肝………………………………………… 90±15%

精密度：

试剂盒的变异系数均小于10%

十二、注意事项

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需要将其摇匀。

4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件

保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

9、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

十三、贮藏条件及保存期

     贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。

保存期：该产品有效期为12个月。