一、引言

焦糖色素是一种允许使用的着色剂，我国对焦糖色使用量的规定除个别产品外均为按生产需要适量使用，其中规定仅有亚硫酸铵法生产地焦糖色允许使用在碳酸饮料中。而以加氨或其铵盐制成的焦糖（Ⅲ类氨法焦糖和Ⅳ类亚硫酸铵法焦糖）会产生4-甲基咪唑，并且4-甲基咪唑是一种能够诱发肿瘤的高水平的化学物质。

焦糖色素被广泛用于食品以及饮料中，所以4-甲基咪唑的含量监控也是必须被重视的，由于4-甲基咪唑分子极性很大，含量很低，所以如何快速、准确地检测出其含量，就成为人们现阶段研究的重点。目前我国国家标准中只有《焦糖色中的4-甲基咪唑的测定-高效液相色谱法》，而对于饮料中的4-甲基咪唑则没有相关检测方法。

沃特世（Waters®）公司所提供的整体解决方案，同时来监控饮料中的4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑。使用沃特世SPE的固相萃取策略来对于复杂的样品基质进行净化，完成对于4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑的提取浓缩，而沃特世HILIC模式的色谱保留，对于极性分子的色谱分离提供完美的效果，最后通过UPLC® H-CLASS PDA以及UPLC/Xevo®  TQ MS的分析，完成出色的定性定量工作。

 
二、实验条件

样品前处理方案

固相萃取SPE解决方案——Oasis® MCX (3cc/60mg) 小柱净化取3g饮料样品，超声5分钟,后待净化。

活化/平衡

3mL 甲醇 /3mL 水

上3mL样品

清洗 A: 2%甲酸水溶液/B: 100%甲醇

洗脱 5%氨化甲醇

氮气挥干

乙腈:甲醇（9:1）定容

上机分析

ACQUITY UPLC H-CLASS PDA超高效液相色谱分离条件： 

色谱柱： ACQUITY UPLC®  BEH HILIC Column; 2.1x100 mm,1.7μm

流动相 A： 乙腈

流动相 B： 5mM 

甲酸铵柱温： 35˚C

检测波长： 215nm

进样量： 5μL

运行时间： 3min

梯度表： Time (min)  Flow (mL/min)   %A  Curve 

                     0.00       0.5                     80    6

                      3.00      0.5                     80    6

ACQUITY UPLC Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱分析条件：

色谱柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC Column; 2.1x100 mm,1.7μm

流动相 A： 乙腈

流动相 B： 5mM 甲酸铵

柱温： 35˚C

进样量： 2μL

运行时间： 3min

梯度表： Time (min)  Flow (mL/min)  %A  Curve

                   0.00         0.5                   80     6

                   3.00         0.5                   80     6

三、实验结果及讨论

3.1 ACQUITY UPLC H-CLASS PDA分析

混合标准品色谱图

饮料空白样品图

基质添加回收色谱图

3.2 ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS分析

混合标准品TIC

 茶饮料样品加标与空白对比分析

 可乐样品加标与空白对比分析 

通过分析结果可以看出，4-甲基咪唑和2-甲基咪唑分子极性很大，一般反相很难保留，多用离子对试剂来增加保留，但由于离子对色谱方式平衡时间很长，增加整体分析周期，同时对于色谱柱以及仪器的损耗很大，最关键是无法进行有效的质谱方法分析。而沃特世公司HILIC模式的极性分析方案可以非常好的进行极性分子的保留，流动相简单，优异兼容质谱条件，使4-甲基咪唑和2-甲基咪唑有非常好的分离效果以及灵敏度。

同时由于目标化合物极性很大，对于前处理的要求非常高，分离提取是个难点，而沃特世公司的固相萃取方案能使样品达到非常好的净化效果，通过Oasis MCX进行保留分离，同时能够减少样品杂质对于色谱柱以及整个仪器系统的损害。由沃特世ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS所提供的超高效性能以及灵敏度，使得4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的分析达到理想效果。

四、结论

4.1.采用ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS可以快速高效地对4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的含量进行测定，ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA灵敏度可以达到1mg/kg，ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS灵敏度可以达到1μg/kg。

4.2.应用沃特世固相萃取SPE解决方案配合HILIC模式色谱保留，对于大极性的小分子有很好的保留以及分离提取的作用，达到理想净化效果以及色谱分离效果。

4.3.从样品前处理到样品色谱质谱分析的整体解决方案，给客户提供一体化的服务解决样品分析过程中可能遇到的所有问题，帮助客户成功！