凋亡细胞的原位末断转移酶标记法(TUNEL法)
 

细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是;细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。大量DNA片段暴露出的3羟基在末断转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。
 

TUNEL细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供

试剂1：酶浓缩溶液(EnzymeSolution)

试剂2：标记溶液(LableSolution)

试剂3：转化剂-POD(Converter-POD)

酶标记抗荧光素抗体(即用型)
 

试验所需其它试剂：
 

非石蜡切片:

·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液(PBS)

·阻断溶液:0.3%H2O2甲醇溶液

·固定溶液:4%多聚甲醛(溶剂pH7.4新鲜配制的PBS溶液)

·渗透液:0.1%Triton甔-100(溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液)
 

石蜡切片:

·二甲苯和乙醇(100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释)

·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液(PBS)

·蛋白酶K工作液10~20mg/ml溶于10mMTris/HCl(pH7.4~7.8)
 

根据需要选择:

·渗透液:0.1%TritonX-100(溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液)

·胃酶溶液(0.25%-0.5%溶于HCl，pH2)或胰酶

·0.1M枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复
 

材料：微波炉，微波输出功率850W-2000W2.选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

抗原微波修复(供参考)

1.组织经福尔马林固定后会产生广泛的蛋白质交连，因此石蜡组织进行凋亡检测时要进行预处理。经我公司科研人员的长期研究认为：TUNEL染色时蛋白酶K的作用有可能引起内源性核酸内切酶的释放，造成假阳性反应，同时过量的蛋白酶K处理可破坏组织的结构，用微波技术替代上述处理可避免上述弊端的出现。

2.微波已被愈来愈多地作为免疫组织化学和原位杂交的预处理过程，经一定温度的微波处理可修复因固定和包埋造成的抗原破坏，打断氨基酸的肽键结合，促进抗原决定簇的暴露，恢复细胞膜的空间结构，增加穿透效应，加速组织处理及染色过程。我们在作TUNEL染色前进行微波修复，可以达到蛋白酶K的功效，取得较为理想的效果，背景染色很浅，凋亡细胞阳性颗粒与背景染色对比非常鲜明。

3.蛋白酶K作用的条件严格，消化度常因组织的不同而在操作中不便掌握。同时蛋白酶K的价格昂贵，而微波已作为一种常用仪器用于免疫组织化学染色中。

(1)切片常规脱蜡入水

(2)将一烧杯盛200ml的0.01M、pH6.0的柠檬酸缓冲液，加热至90～95℃，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入双蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷却，将玻片移至PBS(20～25℃)。(3)PBS洗5min×3次。

(4)加20%正常牛血清室温30min。

(5)将TUNEL反应混合液加在切片上，37℃温育90min(阴性对照片、TUNEL混合液中不加TDT)。

(6)PBS洗5min×3次。

(7)3%H2O2甲醇液室温阻断10min。

(8)37℃温育90min。

(9)加POD转化剂，37℃温育30min。

(10)PBS洗5min×3次。

(11)DAB/H2O2显色。

(12)苏木素淡染，常规脱水，透明，中性树胶封固。

结果：细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征，可确立凋亡细胞。阴性对照片无棕色颗粒。
 

细胞凋亡的检测技术简介(供参考)

一.凋亡细胞的形态学改变

细胞表面：伪足,微绒毛等消失

细胞体形态：细胞皱缩，变形，体积变小

细胞核：染色质浓缩，早期染色质聚集于核膜边呈新月形或环形，晚期碎裂

细胞器：密集但形态及结构完整，早期内质网短暂扩张细胞膜:完好，晚期包裹细胞器或核碎片，形成凋亡小体

在组织中表现：常常以单个细胞散在

发生周围组织反应：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞，上皮细胞吞噬，降解，不发生炎症反应

发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官萎缩，细胞介导的免疫杀伤机制，小剂量毒素作用以及多种病理生理状态
 

二.细胞凋亡的形态学检测方法

(一)凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测

1.制片

(1)常规组织学切片，进行脱蜡和水化。

(2)培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎,所以应采用低速离心制片(250g,离心5min)，并事先将载玻片用1%BSA处理，使细胞易于贴附.离心后涂片,稍经空气中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后转入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20℃待用.

2.染色方法

可用多种方法进行染色。

(1)可采用常规的组织学染色方法，如Giemsa染色，HE染色或Mayer苏木素染色.

(2)采用荧光染料染色，如DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole),PI(propidiumiodide)和7-AAD(7-aminoacetinomycinD).其染色浓度为:DAPI1-2μg/ml;PI5-10μg/ml;7-AAD10-20μg/ml.由于PI染料同时也与RNA结合,所以应将细胞先用RNA酶消化(50Kunitz单位的RNA酶,37℃下作用15min或室温下30min)后,再进行PI染色。

3.结果观察

典型的凋亡细胞形态学改变：细胞体积缩小及变形;核浓染及丧失亚形态结构，可见核染色质呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片;在组织切片上可见巨噬细胞或邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小体。
 TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤

(二)凋亡细胞的电镜观察

采用电镜的常规方法固定，包埋和制片。可用透射电镜或扫描电镜进行观察。透射电镜下，凋亡细胞核染色质浓缩，核膜消失，内质网扩张，而细胞器如线粒体等形态仍保持良好，可见被膜结构包绕的细胞器，即凋亡小体。扫描电镜下，细胞表面结构如伪足，微绒毛等消失，细胞膜呈现波浪状起伏。