谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定

几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料，测定其中α-淀粉酶和β-淀粉活性的差异。

【原理】

两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀酶不耐热，在70℃下15min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

【仪器与用具】

分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；具塞刻度试管（25ml×13）；刻度吸管（1ml，2ml，5ml各1支）；容量瓶（50ml×2）。

【试剂】

麦芽糖标准液（1mg/ml）：称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；

DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 12mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO₂进入。若溶液混浊可过滤后使用；

0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：

A液（0.1mol/L柠檬酸）—称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；

B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L；

取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；

1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

【方法】

1.酶液提取：称取25℃下萌发3～4天的小麦种子1.0g（芽长1.0~1.5cm），置研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm转速下离心10min，将上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀分酶稀释液。

2.麦芽糖标准曲线制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表33-1加入试剂。

表33-1 制作麦芽糖标准曲线配方表

摇匀，置沸水中浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表33-2进行操作。

表33-2 配活力的测定配方表

摇匀，置沸水浴中5min，取出后冷却，加蒸馏水至20ml。摇匀，在540nm波长下比色，记录测定结果。

4.结果计算：用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），再按下式计算α-淀粉酶的活力（A_α），淀粉酶活性以麦芽糖mg·g^﹣1·min^﹣1表示：

A_α=

Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α β）-淀粉酶总活力A_T：

A_T＝

式中 A—淀粉酶活性，A_α为α-淀粉酶的活性，A_T为淀粉酶总活性，主要是α、β淀粉酶的活性；

C_α—α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（查标准曲线求值，以下同）；

C_T—（α β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；

V₁—显色所用酶液体积（ml）；

t—酶作用时间（min）；

V_t—样液稀液总体积（α-淀粉酶为50ml,α β淀粉酶为500ml）；

FW—样品鲜重（g）。