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火箭电泳技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-06-27  浏览次数:322

(一)原理
抗原在含有抗体的凝胶中进行电泳,在电场作用下,抗原向一个方向移动,在移动的过程中,逐步与凝胶中的抗体结合而沉淀呈火箭状。沉淀峰面积越大,说明抗原量越多,二者呈正相关,因此可用于抗原的定量测定。此法具有敏感性高、快速等优点。
(二)材料与试剂
1.0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液配成2%的琼脂。
2.抗原与抗体
3.其它材料同免疫电泳。
(三)操作方法
1.将2%琼脂煮沸溶化后,放入60℃水浴箱中。
2.将适量的抗体用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液稀释至琼脂同样的体积量,放入60℃水浴。
3.将两者充分混合,立即倒成平板。
4.琼脂板冷却后在一侧打孔,孔径3mm,孔距6mm。
5.于孔内分别加入不同浓度的定量抗原。
6.电泳 孔端接负板。电流强度3mA/cm(或电压10V/cm),电泳时间2h~10h。
7.停止电泳,将琼脂板于生理盐水中浸泡24h,中间换液数次。
8.染色、脱色、干燥同免疫电泳。
9.抗体最适量的测定 将已知抗原与抗体以不同浓度梯度进行方阵试验,找出所形成的火箭状沉淀线,轮廓清晰,前端尖窄而闭合的抗体最小量作为抗体的最适用量。
10.标准曲线的绘制 以抗体的最适用量制成琼脂板,分别用已知的不同浓度抗原(同一浓度的也必须做一批,以求平均值)进行电泳,泳毕后染色,测其沉淀峰的高度(或面积),然后以抗原量为纵轴,沉淀峰高度(或面积)为横轴,制成标准曲线。
11.对照组的设置 在测未知抗原的同时,必须设置已知标准抗原作为电泳对照。
(四)结果判定
在已知标准抗原所形成的沉淀峰的高度,在许可的误差范围内,测其待测抗原所形成的沉淀峰的高度(或面积),然后从标准曲线中查出它们相应的抗原含量。
(五)注意事项
1.抗原抗体的用量应当预试,抗原太浓,在一定时间内不能达到最高峰,抗体太浓,则沉淀峰太低而无法测量。预试峰的合适高度为2cm~5cm。
2.用优质琼脂糖。
3.一定条件下,电泳时间要根据峰的形成情况而定。如形成尖角峰形,表示已无游离抗原。如呈钝圆形,前面有云雾状,表示还未到终点。
4.把琼脂板置于电泳槽上搭好桥,再加抗原,或启动电源后,电压极低时加样,以免造成基部过宽的峰型。

 
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