SPA－ELISA技术原理
SPA 能天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合，一个分子的SPA可以同2个IgG分子以化学共价键结合(这不是真正的免疫反应，又称为假免疫反应)，利用这个特性，以SPA代替IgG抗体而应用于ELlSA中。
材料与试剂
1．SPA－HRP结合物,可向有关生物制品厂购买，也可自制，制法如下：
(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。
(2) 加入0.1ml用无水乙醇配制的1%的1－荧光－2，4二硝基苯，室温(20℃)温和搅拌1h。
(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇，室温搅拌1h。
(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液充分透析。
(5) 加入经0.01mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液平衡的SPA 5mg/ml，于20℃温和搅拌2h~3h。
(6) 加入5mg KBH4，混匀后，4℃放置3h。
(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析过夜。
(8) 过Sephadex G100柱(100cm×2cm)，以0.5mol/L pH7.4 PBS液洗脱，流速10ml/h。
(9) 测OD403nm，集SPA－HRP活性部分。
(10) 将高活性组分合并，加入甘油(含30%)置低温保存。也可以采用过碘酸钠法，制法如下：①5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中；②加入无水乙醇配制1%1－荧光－2,4二硝基苯0.1ml，室温混合1h；③加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸馏水配制)室温中混合30min；④加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸馏水配制)，室温缓慢混合1h；⑤以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3缓冲液于4℃透析过夜；⑥加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室温缓慢混合3h即可。
(11) SPA－HRP活性测定：①取猪血清IgG10μg/ml 0.1ml包被反应板，4℃过夜，3×3min冲洗；②加入适量稀释的SPA－HRP溶液0.1ml，置37℃2h，冲洗3×3min；③加入底物显色，显色的深浅应与SPA－HRP的活性成正比。
2．稀释液 0.05Mol/L pH7.4PBS液。
3．包被液 pH9.6碳酸盐缓冲液。
4．洗涤液 0.02Mol/L7.4Tris－HCl缓冲液。
5．底物溶液 pH 5.6磷酸盐－柠檬酸缓冲液：
0.2mo l/L Na2 HPO4(28.40g/L) 25.70ml
0.1mol/L 柠檬酸(19.20g/L) 24.30ml
H2O 50.00ml
用前加40mg邻苯二胺,溶解后加30%H2O20.15ml。
6．终止液 2mol/L H2SO4 1滴。
操作方法
1．检测抗体
⑴ 包被：用pH9.6碳酸盐缓冲液将抗原稀释成50μg－100μg/ml，每孔加0.1ml，37℃感作2h后置4℃过夜。
⑵ 洗涤：以pH 7.4 Tris－HCl液洗涤3×3min。
⑶ 加样：用pH 7.4PBS－Tween液稀释被检样品，每孔0.1ml，37℃感作2h。
⑷ 洗涤3×3min。
⑸ 加SPA SPA经pH7.4 PBS－Tween液稀释后，每孔加入0.1ml，37℃30min。
⑹ 洗涤3×3min。
⑺ 加底物：每孔加底物0.1ml，置室温15min(避光)，再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)终止反应。
2．检测抗原
⑴ 包被：以抗体包被,此抗体必须用SPA不能结合的那些动物的lgG,否则会因为SPA同包被抗体结合而产生假阳性结果,包被条件同上。
⑵ 洗涤。
⑶ 加样。
⑷ 洗涤。
⑸ 加抗体：此抗体必须选用能与SPA结合的动物IgG，否则可因为SPA不能同此层抗体结合而发生假阴性结果。
⑹ 洗涤。
⑺ 加SPA。
⑻ 洗涤。
⑼ 加底物及终止反应。
3．检测培养细胞内病毒抗原
⑴ 盖玻片培养单层细胞。
⑵ 接种易感病毒。
⑶ 用甲醇固定细胞。
⑷ 加抗血清于盖玻片上,37℃孵育1h。Tris－HCl液3×3min洗涤。
⑸ 将PPA滴加在盖玻片上,37℃孵育30min。
⑹ 洗涤3×3min。
⑺ 将盖玻片置底物溶液中,室温15min。
⑻ 以pH7.4 Tris－HCl液稍加冲洗后即可镜检。
结果判定
1．检测抗体或抗原
⑴ 眼观判定：在对照组成立的前提下,和标准阳性孔相近颜色者,均判为阳性(＋)。
⑵ 酶标仪测定：以空白对照孔调零，标准阳性样品校正至某一规定值，测定待测孔，当待测孔OD值或计算值达某一规定阈值时，判为阳性。
2．检测培养细胞内抗原 镜下观察，凡细胞内或细胞膜上出现棕黄色颗粒者，判为阳性。
注意事项
1．目前使用的聚苯乙烯塑料板对抗体的吸附性能较好,，因此对于抗原，特别是大分子(分子量＞100万)的抗原应该进行一些适当的处理,如DNA,应将其事先冻融，使其变成较小分子再包被，如脂蛋白则应改变包被的温度，可在37℃包被过夜。
2．由于SPA－ELISA的敏感性极高，因此也很容易出现非特异性显色,排除非特异性显色的方法除了纯化抗原抗体外，还应该注意：
⑴抗原包被后，再以牛血清白蛋白包被一次或稀释液中加入1%的牛血清白蛋白均可，以占据未包被的一些空隙。
⑵检测血清抗体时，需事先检测大标本量的正常血清效价水平，在检测待检标本时，减去正常的血清效价。
⑶ELISA法加入标记物后往往37℃孵育2h，SPA同IgG的结合不是免疫反应，而是一种化学反应，一般认为，这种结合可能在极短的时间内发生,所以加PPA后，孵育时间可以缩短到0.5h。孵育过久，反而可因为SPA本身吸附到反应板上，造成非特异性显色。
3．叠氮钠对SPA显色影响较大，所以在SPA-ELISA过程中，不宜加叠氮钠做防腐剂，在组织细胞培养固定，也不适宜用甲醛固定，而需采取甲醇或乙醇。
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