间接红血球凝集反应

间接红血球凝集反应（简称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。

原理

以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。

用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。

材料与试剂

1．红血球

2．反应板 分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔两种规格。按孔型又可分为V和U型两种，V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型的血清效价高1～2孔。反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新洁尔灭及紫外线照射等。

3．稀释棒 由合金制成。棒头有8条沟，吸液量为0.025ml，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。它的作用是蘸取、转移、混合液体。为了长期保持棒头的氧化层，每使用20次左右，应过火焰一次。

4．标准滴管 每滴0.025ml。

5．微型振荡器

6．兔血清盐水 作为稳定剂，用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后4℃保存。同时，取所需量加4倍量的2.5％血球悬液，混匀，37℃水浴10min，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清；再以pH7.2PBS稀释成1％兔血清盐水，冰箱保存可供数日内之用。

7．抗原 尽可能使用高纯度的抗原。

8．供试血清或其它含抗体材料 供试血清必须灭活，加9倍2.5％的红血球悬液，37℃水浴10min～20min，进行吸收，然后离心，取上清，即为1:10的血清稀释液。

9．醛化剂 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。

10．优质鞣酸

11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用于红血球致敏。

12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀释液。

13．0.02％牛血清白蛋白PBS液

14．生理盐水

红血球的处理

1．新鲜红血球 新鲜红血球用阿氏液保存于4℃，可供3周内使用。采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜，典型，而且敏感性也比醛化红血球高出1～2个滴度。但用新鲜红血球致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。

2．红血球醛化极其优点

（1）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。

甲醛醛化过程：①将红血球用pH7.2PBS反复洗涤4次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；②按1︰8的比例取红血球（压积）和3％甲醛液（用pH7.2PBS稀释，预先冷却至4℃），缓慢混合，加胶塞4℃作用24h，不时摇动；③倾去上清液，再以1︰2（V／V）加入36％～38％冷的（10℃）甲醛溶液，混匀，再放入4℃24h；④⑷离心去上清，以生理盐水反复洗涤4次。彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成10％悬液甲醛化红血球，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。

戊二醛醛化过程：①取新鲜红血球，以生理盐水洗涤4次；②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1％戊二醛溶液，4℃保存备用；③将100ml 1％冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上）30min；④离心去上清，以生理盐水洗涤4次，最后以PBS液（或生理盐水）配成10％悬液，加1／万硫柳汞，4℃保存。

丙酮醛—甲醛双醛化过程：①取新鲜红血球，洗涤4次，配成8％的悬液；②于红血球悬液中加等量的3％丙酮醛室温电磁搅拌16h～18h；③洗涤5次，再配成8％的悬液；④于红血球悬液中加等量的3％甲醛，电磁搅拌16h～18h；⑤洗涤5次，最后以pH 7.2 PBS配成10％的悬液，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。

（3）醛化红血球的优点：①性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；②重复性好，易标准化。③可较长期保存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。

（4）影响醛化的因素：①红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；②红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；③醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是37℃。但有人认为应于4℃进行醛化；④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会，所以一般以3％醛化浓度为宜。家禽红血球一般醛化1～2次即可，而哺乳动物红血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同。

表 各种双醛化红细胞的结果比较

脉冲／min是¹³¹I标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体量也越多。但是从表5－1中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。

适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。

3．红血球鞣化 多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。

有人认为双醛化后可不必进行鞣化。首都医院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多数意见认为醛化后仍需鞣化比较好。

(1) 鞣化过程：①将10％醛化红血球用生理盐水洗涤2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗涤1次，最后以PBS配成2.50％悬液；②称取优质鞣酸20mg，以生理盐水4ml配成1﹕200的浓度，于37℃水浴，使之充分溶解，然后再以pH7.2PBS稀释成1﹕2 000的浓度。当天配制、当天用完；③1份2.5％红血球悬液与1份1﹕2 000鞣酸液充分混合，37℃水浴10min，1 500r／min离心，去上清，用PBS液洗涤1次；④以0.02％牛血清白蛋白PBS液洗涤1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5％鞣化红血球。

（2）影响鞣化的因素：①鞣酸的质量：这是很重要的，所以必须采用优质鞣酸。分析纯的鞣酸呈面包屑状，不呈面粉状，有折光性；②鞣酸的浓度：浓度过高，可以出现红血球的凝集现象；浓度过低，达不到红血球的活化作用。醛化过的红血球所采用的鞣酸浓度一般比新鲜红血球高10倍。通常以1：2 000为佳；③鞣化时间：鞣化过程一般10min～15min即可完成。时间再长也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化时采用的pH对吸附抗原和血凝滴度影响不大，一般采用pH7.2的PBS液。

红血球的致敏

1．致敏抗原剂量的确定 一般而言，在一定的范围内，抗原的浓度与试验的敏感性呈正比，超过这个范围，再增加抗原，敏感性不会再提高，而且过大，有时会引起非特异性凝集。当采用一种新的抗原时，必须经过试验，选择适当的抗原致敏浓度，即把抗原稀释成几个不同的浓度分别致敏红血球。再用这些致敏红血球分别与标准阳性血清进行试验，与标准阳性血清呈最高滴度的阳性反应的最小抗原剂量，即为该抗原的单位计量。致敏时，根据不同的抗原，可采用2～4个单位计量进行致敏。

2．致敏方法 各种抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白质的致敏方法如下：

所需浓度的抗原 1 份

pH6.4PBS液 4 份

2.50％的鞣化红血球悬液 1 份

混匀，置37℃水浴30min，离心，沉淀后，以2.5％兔血清生理盐水洗涤1次，悬浮于1份兔血清生理盐水中。

3．影响红血球致敏的因素
⑴要有高纯度或高效价的抗原或抗体。

⑵被致敏抗原或抗体的适当剂量和浓度。如抗体一般以μg/ml IgG为宜。抗猪瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗猪水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗猪肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗猪弓形体20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。

⑶pH：除鸡卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使红血球发生自凝。

⑷致敏温度：一般为37℃，范围是20℃～40℃。

⑸致敏时间：一般采用30min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60min。时间过长，会造成红血球的形态不整，反应结果紊乱等。

⑹血球浓度：一般为1％，范围为0.5％～1.5％。

操作方法

可采用试管法、凹窝板法和微量法。前者稀释度准确、结果清晰、终点明确。后者具有节约材料、操作方便、结果出现迅速等优点。

试管法的供试材料用兔血清盐水二倍递减稀释，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振荡，混匀后置室温，红血球完全沉下（需数小时）或过夜后判定结果。

每次试验需做下列对照：①血清对照：最高浓度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球对照：兔血清盐水＋鞣酸血球；③致敏血球对照：兔血清盐水＋致敏血球；④标准阳性血清对照：稀释已知滴度的阳性血清，加致敏血球以检验试验的敏感性是否前后一致。

结果判定

＋＋＋＋：管底呈细密的颗粒凝集，边缘不整齐。

＋＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，边缘折叠。

＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，如伞状。

＋ ：管底大部分复以光滑片层，边缘稍厚。

± ：较“＋”面积更小，中央有沉积的红血球。

— ：红血球沉积在管底中央，如小圆盘或钮扣状。

以“＋＋”为滴度终点。