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菌种保存过程的常见问题?看看专家怎么解答!

放大字体  缩小字体 发布日期:2022-05-09  浏览次数:193
核心提示:分离纯化后才能获得单一菌株,单一菌株进行菌种保藏才有意义,防止菌种交叉污染和变异,这也是菌种保存的基本原则1、菌种保存管能
 

分离纯化后才能获得单一菌株,单一菌株进行菌种保藏才有意义,防止菌种交叉污染和变异,这也是菌种保存的基本原则

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1、菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗?

 

答:可以。对于霉菌等真菌需培养7 天进行保存,而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存,保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝,相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。

 

2、所有的菌都能保存吗?如果不是的话,什么样的菌可以保存?什么样的菌不可以保存?

 

答:可以。菌种保存的原理是预防或减缓DNA 复制时自发突变导致菌种退化,因此要创造代谢不活泼的状态,而菌种保存时使菌种进入休眠态(孢子、芽孢),并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境,创造的环境越接近此状态,所保存的菌种的时间就越长,所以从原理上讲,所有菌种都可用这种方法保存, 但需要注意的是,苛刻菌(如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌)等特殊细菌保存时,需-80℃或更低温度保存,才可以做到更长期的保存。

 

3、能用菌种保存管永久保存菌株吗?

 

答:温度越低,保藏效果越好。从目前的试验数据及实际保存效果来看,-20℃可保存1-5 年,-80℃或液氮中可保存5-10 年,不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同(例如:大肠、沙门等常规细菌-20℃我们目前可以保存到6年)。但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定,确定菌株无变异。


4.菌株保存的是第三代,-80℃保存,再取出来活化的话属于第几代?

:保存的是第三代复活出来后,如果采用平板或肉汤活化相当于转接了一代,就是第四代了,如果还在瓷珠里的话就还是原来的代数。如果是保存在斜面上,这一支斜面一直就是第三代,如果转接到另一支斜面就是第四代了。传代原则,菌株活化复苏不论以任何形式繁殖了一次就算是传了一代。但如果仅是物理位置的转移没有繁殖就不是传代,需要注意。

 

5.刚买回来的阳性菌株是第0代吗?

:一般菌株你买回来的时候上面都会写明第几代,常规来说都是第0代的。像购买的ATCC或CICC的冻干粉都是标记为0代的。

6.菌株传代保存到瓷珠里一定要挑单菌落吗?

:不一定非挑单菌落,但是一定要挑相同特征的菌落,就是说从同一个菌落纯化出来的,以保证它们的特性完全一致。原则是尽量多挑,宁多勿少。 


7.怎样延长菌株的保存时间呢?

大量的实验证明菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最好的,越接近这种保存条件,菌株的保存时间越长。

 

8.怎样纯化菌株?

纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转接一次,这就相当于纯化了。

 

9. 我们保存的一代菌株是不是要重新传代保存呢,认证老师会不会认为这是个错误?

答:应该不会,认证老师不会提出这种问题的,不过最好是一代菌株保存一些、二代菌株保存一些,使用时工作菌株最好使用第三代菌株,一代菌株可作为长期保存用。

10. 为何要将第三代作为工作菌株?

答:多传代几次后菌株的活力会明显提高,但最多传代到第五代后就不能用了,因为第五代后菌株虽然不会完全变异,但变异率会明显增加,因此选用第三代作为工作菌株是比较合适的,若使用第一、第二代菌株活力没有那么强。

 

11.用瓷珠管反复上下摇匀,有泡沫不容易吸出来,怎么办?

答:不必特别剧烈大尺度的摇动瓷珠管,稍微上下晃动就可以;如果确实有泡沫的话可以静置一会,让菌株多吸附一下瓷珠也是可以的。

 

12. TSA斜面一般多少度保存,可以放在冷藏里吗?

答:2-8℃保存,放在冷藏是可以的;注意弧菌和绿脓杆菌要放到室温20-25℃保存,否则会很快死亡。

 

13.如果TSA斜面放在冷冻里面,会有什么影响?

答:琼脂冷冻后性状会发生改变,会变得很软,结构发生改变,所以不建议冷冻;如果要冷冻的话就采用甘油保存法或瓷珠保存法。

 

14.用瓷珠管保存产气荚膜梭菌老是保存不好!做好瓷珠管之后瓷珠管要放到厌氧袋里面再放到-20℃么?

答:如果冷冻保存最好放在厌氧袋里再-20°保存,保存效果还可以;或者可以采用庖肉培养基保存,它是一种液体培养基,将产气荚膜梭菌接进去然后2-8 ℃保存,可以保存一年没有问题,在厌氧环境下保存效果最好。

 

15、菌种保藏时为什么要进行分离纯化?

 

答:分离纯化后才能获得单一菌株,单一菌株进行菌种保藏才有意义,防止菌种交叉污染和变异,这也是菌种保存的基本原则。

 

16、菌种保存管对于平板来说,对挑选菌落个数有要求吗?还是将整个平板的菌落全部刮入管中?

 

答:对于要保存的细菌一般是要进行2-3 次的纯化,要保证一个平板上的菌是由单一菌落传代而来的,所以在细菌保存的过程中,为了保证制备的菌悬液可以达到3-4MCF,是可以将整个平板的的细菌全部刮到管中的,如果平板长的比较满一般半个平板就够用,具体用量也根据菌种的不同有所差异,如霉菌、酵母菌在保存时,不适合用浊度法。

 

17、对于液体培养基培养的纯菌,是否也可以用咱们的菌种保存管?如果可以的话,怎么操作?

 

答:是可以用的,如果液体培养基能保证是纯菌的话,可以直接离心,弃掉上清,然后把保存管中液体吸进去充分混匀,然后再转移到菌种保存管中,整个过程要注意无菌操作。不过,一般菌种保存管最好选择平板菌落进行保存,因为液体培养基中有杂菌是不易观察出来的。

 

18、为什么在菌种保存时,要上下颠倒?为什么不能旋摇?

 

答:上下颠倒,可使菌悬液充分混匀,菌株充分、均匀地吸附到小瓷珠上,旋摇不利于菌悬液充分混匀,反而会使菌株全部沉淀于管底。

 

19、为什么在使用时要将管内的液体尽可能多的吸出?

 

答:吸出液体可避免反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤,加快复苏的过程,因此,要尽可能的将与菌种混匀后的保存液吸净。而常用的甘油法,在复苏的过程中需用水浴锅快速溶解,在此过程中,对菌株伤害较大。

 

20、在使用后,菌种保存管的保存环境?需要-80℃冰箱吗?

 

答:本公司菌种保存管采用的是低温冷冻保存法,因此,使用后,需放置低温环境,如-20℃、-80℃或液氮中保存,而且温度越低,保存效果越好。用户需根据菌种的保存要求选择具体保存温度。

 

21、为什么说,如果有条件的话,菌种保存管最好置于-80 冰箱或液氮中?

 

答:因为,贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成,可极大降低冰晶形成对细菌的伤害,同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境,从而延长细菌保存的时间。

 

22.菌株保存是-70℃还是-80℃有具体标准规定么?

:其实是有标准的,《SN/T 2632-2010 微生物菌株常规保藏技术规程》是关于菌株保藏的一个标准,大家可以学习一下,各个保存方式都有介绍,但是瓷珠是比较新兴的保存方式暂时里面还没有收录。

 

23、为什么在取用菌株时,操作过程要求快速?

 

答:菌种保存复苏的原则,要求慢冻快融,之所以要求快速,是因为在菌种复苏的过程中, 长时间的溶解过程会对所保存的菌种造成损伤,而我们经过改良的保存方法最大程度的避免复苏所造成的影响,但我们还是建议遵循菌种的保存复苏原则,保证所复苏菌种的复苏率。

 

24、将菌株反复冻存,到底对菌株有什么影响?

 

答:低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶,从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感,而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温(不是一般冰箱)进行冷冻时,会产生冰晶,冰晶呈针状,极易导致细菌的严重损伤。用电镜观察,可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔,当从低温下移出并开始升温时,冰晶又会变大,故反复冻存,会对菌株造成极大损伤。


编辑:songjiajie2010

 
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