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将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水(PBS)：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制
搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml)
有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
荧光显微镜
玻片架
滤纸
37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一
30min
定时间(参考：30min)。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，
pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++
--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)
或(-)，即可判定为阳性。
注意事项
1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之
间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，
影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数
小时，一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温(25℃左右)，高于 37℃可加强染色效果，
但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。低温染
色过夜较 37℃30 min 效果好的多。
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染
色的干扰。
(1)标本自发荧光对照：标本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。
(2)特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗
体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光， 待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
