1.2.2.3.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管内，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10^-4~10^-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

1.2.3. 供试液的制备

1.2.3.1.无抑菌活性的供试品供试液的制备 

◆稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 

◆液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加入90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）。

◆固体、半固体、粘稠性供试品供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。

1.2.3.2.具有抑菌活性的供试品供试液的制备

当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：

◆ 培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时可加大增菌液的用量。

◆离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

◆薄膜过滤法：取规定量试验可能用的稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落数。

◆ 中和法：选取适宜的中和剂如磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸，洗必泰制剂加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），卤素中加入硫代硫酸钠（0.1%）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性后测定。

1.2.4. 菌液组 测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

1.2.5.试验组

1.2.5.1.平皿法：取试验可能用的稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。 

1.2.5.2.培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。 

1.2.5.3薄膜过滤法：取规定量试验可能用的稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。至少要一张膜。 

1.2.5.4. 离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心 20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂洗涤管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。  

1.2.6. 供试品对照组 

取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）。

1.2.7.稀释剂对照组

若供试液需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法等处理时，应增加稀释剂对照组，用稀释剂代替供试品，加入试验菌，使最终浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和计数方法计数。

1.2.8.回收率计算 

1.2.8.1.试验组回收率计算

试验组的菌回收率＝ 试验组的菌回收率—供试品对照组平均菌落数×100%菌液组的平均菌落数 

1.2.8.2. 稀释剂对照组回收率计算 

试验组的菌回收率＝ 稀释剂对照组平均菌落数 ×100%菌液组的平均菌落数

计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

1.2.8.3. 结果判断

在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。