1.1 食品检样

巴氏消毒牛奶、原味面包

1.2 仪器

全自动菌落分析仪

立式压力蒸汽灭菌器

生化培养箱

均质机

恒温水浴锅

培养皿（直径90mm）

1.3 试剂

琼脂

平板计数琼脂（PCA）

氯代三苯基四氮唑（TTC）

首先将购买的巴氏消毒牛奶和面包放置使它们过期，牛奶过期 8h，面包过期96h，通过过期处理有助于菌落蔓延的形成。整个检验步骤按照国家标准 GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》（以下简称国标）进行。每种样品做10^-2、10^-3、10^-4，3个连续稀释度，每个稀释度每组做12个检验平板、2个空白平板。

2.1 对照组

按照国标正常检测，制成检验培养基平板后培养基不加覆盖。

2.2 加覆盖组

按照国标法制作检验平板后，加入 5 mL 灭菌培养基覆盖住原培养基。采用两种不同的覆盖方案，加覆盖组一是检验平板做好后，加入的覆盖培养基的琼脂质量分数为2.0%（配方：琼脂 20g，水 98g），加覆盖组二琼脂含量质量分数为4.0%（配方：琼脂40g，水960g）。

2.3 加滤纸组

培养皿灭菌前在培养皿皿盖中放置两层滤纸，目的是在菌落总数检测培养的过程中可以吸收一定量的冷凝水，防止微生物细胞或孢子随着冷凝水迁移，减少菌落蔓延的发生，然后按照国标法制作不加覆盖的平板。

2.4 加 TTC 组

每 100 mLPCA 培养基中加人0.1%TTC溶液2.5mL混匀，按照国标法制作不加覆盖的平板。TTC 染色液能够使菌落呈现红色而培养基和食品残渣颗粒不会被染色，有利于菌落计数时真实菌落的鉴别，且不会对微生物特别是细菌的生长繁殖造成影响。

将制成的平板翻转，36 ℃培养 48 h。首先计数不同组别、不同稀释度检验平板菌落蔓延情况，然后使用全自动菌落分析仪计数不同稀释度不蔓延平板的微生物菌落数量，空白平板均无菌落生长。根据检测结果分别统计过期牛奶的菌落蔓延情况、过期面包菌落蔓延情况和过期牛奶面包的菌落总数检验情况，制成表1~表3。

3.1 过期巴氏消毒牛奶不同组别、不同稀释度菌落蔓 延情况统计

过期巴氏消毒牛奶不同组别、不同稀释度菌落蔓延情况统计见表 1。

3.2 过期面包不同组别、不同稀释度菌落蔓延情况统计

过期面包不同组别、不同稀释度菌落蔓延情况统计见表 2。

3.3 菌落总数检测结果

菌落总数检测结果见表 3。

从以上3.1过期巴氏消毒牛奶不同组别、不同稀释度菌落蔓延情况统计表和3.2过期面包不同组别、不同稀释度菌落蔓延情况统计表中可以看出不经过处理的对照组平板，菌落蔓延非常严重，巴氏消毒牛奶和面包分别达到了77.8%、94.4%；加TTC组菌落蔓延也很严重，均达到了75.0%，与对照组相比有所改善；加滤纸组菌落蔓延分别达到了69.4%和75.0%，菌落蔓延对检验的影响也较大；加覆盖组一菌落蔓延分别达到了38.9%、44.4%，对菌落蔓延有较好的抑制作用，可以保证检验得到结果；加覆盖组二菌落蔓延分别达到了25.0%、27.8%，菌落蔓延的到了较好的控制，是防止菌落蔓延所有试验方法中最佳的。

对 3.3 菌落总数检测结果分析：以过期巴氏消毒牛奶为例：对照组、加 TTC组、加滤纸组、加覆盖组一、加覆盖组二平均菌落数分别为91000、91000、87000、89000、80000 CFU/mL，各组得到的数据相差不大，对食品检验的最后报告不会造成实际的影响，说明检验过程中通过一定的方法防止菌落蔓延对检验结果的影响较小，可以在实际工作中采用。分析过期面包的检验结果可以得到同样的结论。

控制菌落蔓延在食品微生物检测中非常重要，面包、馒头、蛋糕、米粉、饼干等多种食品在检验过程中容易出现菌落蔓延情况，其他食品的检验也会或多或少出现，对检验工作造成困扰。加覆盖组二对菌落蔓延的抑制作用很明显，相比对照组平均下降52.8%和66.6%；加覆盖组一的效果也不错，相比对照组平均下降38.9%和50.0%。

同一种食品采用不同的配方、加工工艺、不同的温度对微生物的影响不同，检测的结果也有不同。本次研究的食品试验材料只有2种，相对较少；同时受到配置稀释液时间等限制，不可能一次做大量平板，对研究结果造成一定影响，结论仅供参考。