第1节 微生物遗传变异的物质基础
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1.1. 遗传和变异的物质基础
20世纪50年代以前，许多学者认为蛋白质对于遗传变异起着决定性的作用，而通过对高等动物和植物染色体的化学分析，发现染色体由核酸和蛋白质，并且主要是脱氧核糖核酸（DNA）组成。因此，要回答究竟是蛋白质还是核酸对于遗传变异起着决定性的作用，经研究，人们认识到以微生物为研究材料具有特殊的优越性，于是通过以下三个经典的实验，充分证明了遗传变异的物质基础是核酸。
1.1.1. 肺炎双球菌的转化实验
转化是指受体细胞直接摄取供体细胞的遗传物质（DNA片段），将其同源部分进行碱基配对，组合到自己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状，这种变异现象，称为转化。
肺炎双球菌的转化现象最早是由英国的细菌学家格里菲斯(Griffith)于1928年发现的。肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)是一种病原菌，存在着光滑型(Smooth简称S型)和粗糙型(Rough简称R型) 两种不同类型。其中光滑型的菌株产生荚膜，有毒，在人体内它导致肺炎，在小鼠体中它导致败血症，并使小鼠患病死亡，其菌落是光滑的；粗糙型的菌株不产生荚膜，无毒，在人或动物体内不会导致病害，其菌落是粗糙的。格里菲斯以R型和S型菌株作为实验材料进行遗传物质的实验，他将活的、无毒的RⅡ型（无荚膜，菌落粗糙型）肺炎双球菌或加热杀死的有毒的SⅢ型肺炎双球菌注入小白鼠体内，结果小白鼠安然无恙；将活的、有毒的SⅢ型（有荚膜，菌落光滑型）肺炎双球菌或将大量经加热杀死的有毒的SⅢ型肺炎双球菌和少量无毒、活的RⅡ型肺炎双球菌混合后分别注射到小白鼠体 内，结果小白鼠患病死亡，并从小白鼠体内分离出活的SⅢ型菌。格里菲斯称这一现象为转化作用(图5－1)，实验表明，SⅢ型死菌体内有一种物质能引起RⅡ型活菌转化产生SⅢ型菌，这种转化的物质（转化因子）是什么?格里菲斯对此并未做出回答。1944年美国的埃弗雷(O．Avery)、麦克利奥特(C. Macleod)及麦克卡蒂(M．Mccarty)等人在格里菲斯工作的基础上，对转化的本质进行了深入的研究。他们从SⅢ型活菌体内提取DNA、RNA、蛋白质和荚膜多糖，将它们分别和 RⅡ型活菌混合均匀后注射人小白鼠体内，结果只有注射SⅢ型菌DNA和RⅡ型活菌的混合液的小白鼠才死亡，这是一部分 RⅡ型菌转化产生有毒的、有荚膜的SⅢ型菌所致，并且它们的后代都是有毒、有荚膜的。由此说明RNA、蛋白质和荚膜多糖均不引起转化，而DNA却能引起转化。如果用DNA酶处理DNA后，则转化作用丧失。
图5－1. 肺炎双球菌的转化现象
1.1.2. 噬菌体的感染实验
证明DNA是遗传物质，还可用T2噬菌体感染大肠杆菌的实验来证实。1952年赫西(A．Hershey)和蔡斯(M．Chase)用32P043-和35S042-标记T2噬菌体，因DNA分子中只含磷不含硫，而蛋白质分子中只含硫不含磷。故将T2噬菌体的头部DNA标上32P，其蛋白质衣壳被标上35S。用标上32P和35S的T2噬菌体感染大肠杆菌，经短时间的保温后，T2噬菌体完成了吸附和侵入的过程。将被感染的大肠杆菌洗净放入组织捣碎器内强烈搅拌，然后离心沉淀。分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记，结果全部35S和噬菌体在上清液中，全部32P和细菌聚集在沉淀物中。这说明在感染过程中 噬菌体的DNA进人大肠杆菌细胞中，它的蛋白质外壳留在菌体外。进入大肠杆菌体内的T2噬菌体DNA，利用大肠杆菌体内的DNA、酶及核糖体复制大量T2噬菌体，又一次证明了DNA是遗传物质(图5－2)。
1.1.3. 烟草花叶病毒的拆开与重建实验
烟草花叶病毒(TMV)由蛋白质外壳和核糖核酸 （RNA）核心所构成，可以从TMV病毒分别抽提得到它的蛋白质部分和RNA部分，把这两个部分放在一起，可以得到具有感染能力的烟草花叶病毒颗粒。1965年，美国的法朗克一康勒特(Fraenkel Conrat)将烟草花叶病毒拆成蛋白质和RNA(该病毒不含DNA)，分别对烟草进行感染实验，结果发现只有RNA能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具有蛋白质外壳和RNA核心的烟草花叶病毒。烟草花叶病毒有不同的变种，各个变种的蛋白质的氨基酸组成有细微而明显的区别，后来法朗克一康勒特又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开，在体外分别将甲病毒的蛋白质和乙病毒的RNA结合，将甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白质结合进行重建，并用这些经过重建的杂种病毒分别感染烟草，结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的RNA(图5－3)。这一实验结果说明病毒蛋白质的特性由它的核酸(RNA)所决定，而不是由蛋白质所决定。可见在这里同样证明了核酸(RNA)仍然是遗传物质的基础。
图5－2. T2噬菌体感染试验示意图
到目前为止，发现只有一部分病毒（包括动物、植物病毒和噬菌体）的遗传物质是RNA，其他生物的遗传物质都是DNA。
图5－3. 病毒重组实验示意图
1.2. DNA的结构与复制
1.2.1. DNA的结构
现在我们已经知道，DNA是遗传物质的基础，那么，DNA为什么能起遗传作用，它又是怎么起作用的呢？这与它的分子结构是密切相关的。
DNA又称脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid),是一种高分子化合物，其基本单位是脱氧核苷酸,相对分子质量最小的为2.3×104，最大的达1×1010，比蛋白质相对分子质量(5×103~5×106)大。沃森(Watson)和克里克(Crick) 于1953年由X射线衍射结构分析提出了DNA分子双螺旋结构理论和模型，认为DNA是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手螺旋结构. (图5—5)。多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定,一条从5’到3’，另一条从3’到 5’。链间有螺旋型的凹槽，其中一条较浅，叫小沟；另一条较深，叫大沟。每条多核苷酸链上均有四种碱基：A(腺嘌呤adenine)、T(胸腺嘧啶thymine)、C (胞嘧啶cytosine)、G(鸟嘌呤guanine)有序地排列，它们以氢键与另一条多核苷酸链的四种碱基相连,A与T配对,C与G配对，这种由氢键连接的碱基组合，称碱基配对(图5－4)。一个DNA分子可含几十万或几百万碱基对，相邻碱基对平面之间的距离为0.34nm，即顺中心轴方向,每隔0.34nm有一个核苷酸,以3.4nm为一个结构重复周期，包括10对碱基。核苷酸的磷酸基与脱氧核糖在外侧，通过磷酸二酯键相连接而构成DNA分子的骨架。脱氧核酸环平面与纵轴大致平行，双螺旋的直径为2.0nm。
图5－4. DNA双螺旋结构中碱基配对示意图
此模型所描述的资料来自在相对湿度为92％时所得到的DNA钠盐纤维，这种DNA称为B型DNA（B-DNA），B-DNA双螺旋的二级结构既规则又很稳定，但不是绝对的，它在环境中不停地运动，如室温下DNA溶液中有部分氢键会断开，造成这些部位结构多变。水溶液及细胞中天然状态DNA大多为B-DNA，但若湿度改变或由DNA钠盐变为钾盐、铯盐等则会引起构象的变化，形成A-DNA、C-DNA等构象。此外还有Z-DNA, Z-DNA结构是1979年由Rich提出的(图5－5)，该模型的提出曾一度动摇过右手螺旋学说。现已证明，左手螺旋Z-DNA只是右手螺旋结构模型的一个补充和发展。B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变构成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后活性明显降低。
图5－5. 两种不同形式的DNA
DNA除了具有右旋、左旋的双股螺旋结构外，后来科学家在实验室设计并合成了三股螺旋的DNA（图5－6），它由15－25个核苷酸组成的短链反义核酸绑到双股DNA中形成。1992年我国科学家首先发现具有三股螺旋的天然DNA。现三股螺旋的DNA的存在已被国际公认。
图5－6. 三股螺旋结构的DNA
一般而言，特定的种或菌株的DNA分子，其碱基顺序固定不变，这保证了遗传的稳定性。如果DNA的个别部位发生了碱基排列顺序的变化，则会导致菌株死亡或发生遗传性状的改变。在现代细菌分类鉴定中，通过测定G十C百分含量确定属、种或菌株。
基因是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。它是DNA分子上一个具有特定碱基顺序，即核苷酸顺序的片断。按功能可分三种：第一种是结构基因，编码蛋白质或酶的结构，控制某种蛋白质或酶的合成。但tRNA和rRNA基因不编码蛋白质。第二种是操纵区，它的功能像“开关”，操纵三个结构基因的表达。第三种是调节基因，它控制结构基因。例如：大肠杆菌三种有关利用乳糖的酶是由三个结构基因决定的。先由调节基因决定一种阻抑蛋白封闭操纵区的作用，使三个结构基因都不能表达，阻抑了酶的合成。当培养基中有乳糖时阻抑蛋白失活，不能封闭操纵区，因而结构基因得以表达，合成能利用乳糖的酶。
一个基因的相对分子质量大约为6×l05，约有1000个碱基对，每个细菌约具有5000至10000个基因。基因控制遗传性状，但不等于遗传性状。任何一个遗传性状的表现都是在基因控制下的个体发育的结果。从基因型到表现型必须通过酶催化的代谢活动来实现。基因直接控制酶的合成，即控制一个生化步骤，控制新陈代谢，从而决定了遗传性状的表现。
1.2.2. DNA的复制
菌株细胞在分裂之前，只有DNA十分精确地进行复制，才能保证微生物的所有属性都得到遗。而DNA的独特的半保留式的自我复制能力，确保了DNA复制的精确性，并保证了一切生物遗传性的相对稳定。DNA的自我复制大致如下：首先是DNA分子中的两条多核苷酸链之间的氢键断裂，双螺旋解旋和分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基排列顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条多核苷酸链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，又以氢键连接成新的双螺旋结构 (图5－7)。
DNA复制时，其双连首先解开，形成复制叉。复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质，复制叉移动的方向和速度虽是多种多样的，但以双向等速为主。无论是真核生物还是原核生物，它们的DNA
图5－7. DNA的复制方式
复制都是半保留、半不连续复制，复制过程都存在引发、延长和终止3个阶段，都必须有相应功能的蛋白质（如SSB）和酶（如DNA聚合酶）参与。但真核生物每条染色体上都可以有多处复制起始点，而原核生物只有一个起始点；真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上的DNA的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的DNA的复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉。
1.2.3. RNA
RNA(ribonucleic acid) 又称核糖核酸，有四种类型：tRNA、rRNA、mRNA和反义RNA。它们均由DNA转录而成，和DNA很相似，不同的是以核糖代替脱氧核糖，以尿嘧啶(uracil，简称U)代替胸腺嘧啶(T)。因此，RNA链中的碱基配对为：A—U、U—A、G—C、C—G等四种。tRNA叫转移RNA，是模板与氨基酸之间的接合体，其上有和mRNA互补的反密码子，能识别氨基酸及识别mRNA上的密码子，在tRNA—氨基酸合成酶的作用下具有转运氨基酸的作用。其在蛋白质生物合成的起始作用中，在DNA反转录合成中及其他代谢调节中都起重要作用。细胞内t RNA的种类很多，每一种氨基酸都有其相应的一种或几种t RNA。rRNA即核糖体RNA ，它和蛋白质结合成的核糖体为合成蛋白质的场所。rRNA 含量大，是构成核糖体的骨架。大肠杆菌核糖体有三类rRNA ：5SrRNA,16S rRNA ,23RNA。 mRNA叫信使RNA，mRNA 上每三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为密码，也叫三联子密码。mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的，贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递给蛋白质。每一种多肽都有一种特定的 mRNA 负责编码，所以细胞内mRNA 的种类是很多的，但是每一种mRNA的含量又十分低。反义RNA是能与DNA的碱基互补，并能阻止、干扰复制转录和翻译的短小 的RNA。反义RNA起调节作用，决定mRNA翻译合成速度。由mRNA、tRNA、反义RNA和rRNA协作合成蛋白质。
1.3. 遗传物质的存在形式
真核生物(人、高等动物、植物、真菌、藻类及原生动物)的遗传物质是DNA，其染色体由DNA和蛋白质等组成。真核生物的染色体不止一个，少的几个，多的几十或更多，染色体呈丝状结构，细胞内所有染色体由核膜包裹成一个细胞核。真核微生物染色体以外的DNA主要以细胞器形式存在，这些细胞器中的DNA常呈环状，细胞器DNA的含量只占染色体DNA的1%以下。
原核微生物的染色体往往只有一个，是由单纯的DNA或 RNA组成。细菌和放线菌的遗传物质单纯由一条DNA细丝构成环状的染色体，拉直时比细胞长许多倍，为双链的DNA，与很少量的蛋白质结合，没有核膜包围，它在细胞的中央，高度折叠形成具有空间结构的一个核区。由于含有磷酸根，它带有很高的负电荷。原核微生物DNA的负电荷被Mg2+离子和有机碱：精胺、亚精胺和腐胺等中和。真核生物DNA的负电荷被碱性蛋白质：组蛋白和鱼精蛋白中和。病毒中的遗传物质是DNA或 RNA，为双链或单链，呈线状或环状，且病毒的核酸都不与蛋白质相结合。原核微生物染色体外的DNA称为细菌质粒，例如原核生物中的性因子(F因子)，抗药性因子(R因子)等，它们的DNA只占染色体DNA的一小部分。
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