三杂交系统(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA间的相互作用。Senguptaxi等首先报道了应用三杂技系统分析金属调节蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)与金属反应元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV转录激活蛋白(trans-activator protein， Tat)与HIV转录激活反应元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列间的作用。 　　

三杂交系统的基本原理是将一个已知的RNA结合蛋白与转录因子的DNA结合domain(如LexA)构建第一个融合蛋白，第二种蛋白(待选的RNA结合蛋白)与转录激活结构域构建融合蛋白。此外构建和表达一杂合RNA，含有二个不同的结合位点。当RNA与二个RNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。如Dhruba等在IRP1与IRE的RNA相互作用的研究中，第一个RNA结合蛋白选用噬菌体MS2被壳蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可识别RNA中的21nt的茎环序列，并与之有较高的亲和力。将其与LexA融合构建杂合蛋白。IRP1与Gal4的激活结构域(activation domain)融合构建另一个杂合蛋白。IRE mRNA在非编码区有21nt的茎环区序列，编码区编码与IRP1特异性结合的蛋白序列。在实验中他们用一质粒表达杂交RNA，含2个MS2 coat protein结合位点和1个IRE。 　　

三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-蛋白间相互作用的新方法。与双杂交系统相比，杂交RNA与杂交蛋白有些不同：首先，杂交RNA分子可能不是生理结构，杂交的不同RNA组分对正常结构会有一定影响。但Dhruba的研究表明，局部、相对稳定的结构区如MS2 coat protein，IRP1识别位点等可在体内共存于同一杂交RNA分子中。其次，这些RNA中的茎环区结构相当稳定，RNA只要形成部分正确结构，则足以介导转录激活作用。 　　

象双杂交系统一样，三杂交系统具有广泛的应用。〈1〉应用此系统可分析确定RNA--蛋白作用的精确结构域，甚至单个核苷酸或氨基酸残基。〈2〉用于鉴定和克隆识别结合有重要生理功能RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。〈3〉通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白结合的RNA。〈4〉有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA-RNA间的相互作用。