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PCR产物及凝胶回收试剂盒--MagExtractor®-PCR & Gel Clean u

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-05-22  浏览次数:3202
产品索引 5872
中文名称: PCR产物及凝胶回收试剂盒
英文名称: MagExtractor®-PCR & Gel Clean up-
产品编号: NPK - 600

产品类别:

分子生物学
生产厂家: TOYOBO
产品价格: 300元
产品规格: 50次
DNA Fragment Purification Kit
MagExtractor®
-PCR & Gel Clean up-
使用说明书
(Code No. : NPK – 601)
TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
OSAKAJAPAN
 —目录—
[1] 前言 ........................................................................................... 1
[2] 纯化流程...................................................................................... 2
[3] 试剂盒中所包含的物品................................................................. 3
[4] 试剂盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
[5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
[6] 回收琼脂糖凝胶........................................................................... 5
[7] 疑难解答...................................................................................... 8
 
注意:
       本试剂盒中所包含的都是研究用试剂。请不要用于诊断,临床等场合。在使用本试剂盒的时候,请严格遵守实验室的基本注意事项,注意安全。由于本试剂盒内含有对人体有害的试剂,所以请务必严格遵守各试剂的相关使用说明书,按要求使用保护罩等防护措施。

 [1] 前言
       MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic(盐)试剂存在的情况下,核酸能吸附在硅胶上的特性1,用于手动对DNA片段进行纯化。本试剂盒采用磁硅胶粒子,若使用磁性台架,则能最大限度地减少复杂的离心操作,能够快速地的纯化DNA片段。
1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
特征
·从DNA溶液(约100μl),以及TAE·TBE琼脂糖凝胶(约0.3g)中,
能够以平均回收率60~70%比例回收DNA片段(约100bp~50kbp)。
·能够在5分钟之内从DNA溶液中,或者在15分钟之内从琼脂糖凝胶
中回收DNA片段。
·由于在室温下琼脂糖凝胶可以被融解,因此无需进行加热反应。
 
* 要彻底去除混杂在回收液中的乙醇时则需要进行加热处理(55℃)。
试剂盒的用途
·脱盐,去除dNTPs。
·去除引物。
·去除酶(碱性磷酸酶等)。
·从电泳后的琼脂糖凝胶块中回收DNA。
回收的DNA的用途
·RI.Non-RI测序反应
·限制酶反应
·标记反应
·杂交反应
·连接反应
·转化反应
·扩增反应
[2] 纯化流程      
 下图显示为使用MagExtractor-PCR &
  Gel Clean up-时的纯化流程。

纯化DNA片段
Elute
75%乙醇
洗净液
溶出液
     磁石
磁性或离心分离
磁珠
Wash
 
Bind
 
Melt
 
凝胶块
吸附液
电泳后的凝胶

[3] 试剂盒中所包含的物品    
 
       本试剂盒中包含以下试剂。(200次份)
      
 
试剂量
保存条件
吸附液*
88ml
避光室温保存
洗净液*
132ml
室温保存
磁珠
7ml
室温保存
 
*吸附液,洗净液在低温情况下会析出结晶。请一边用手捂暖,一边
将其倒转混合让结晶溶解后使用。另外,吸附液及洗净液内含有蛋白
变性剂。在使用时务必注意,万一沾到身体,请立刻用清水冲洗。
 
[4] 试剂盒以外所需要的其他物品
 
1.试剂
·灭菌蒸馏水<溶出液>
·75%乙醇<洗净用>
 
2.器具,器材
·1.5ml小型试管用磁性台架
·简易台式离心机
·漩涡混合器
·Heat Block 55℃(用于在需要去除混于回收液中的乙醇的场合)
 
*可使用本公司的磁性台架Magical Trapper(Code No.:MGS-101)等产品。
 [5] 回收DNA溶液
 
1.前言
·本操作程序用于从DNA溶液(约100μl)中回收DNA片段。
·能够回收的DNA大小约为100bp~50kb。另外,40bp以下的核酸
几乎能够被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量为每30μl磁珠大约吸附5μg。使用时请以2.5μg左右为参考量。
·能够从PCR反应液,限制酶反应溶液,碱性磷酸酶反应液等各种反
应液中回收DNA。
·回收后的DNA,能够用于限制酶处理、测序、连接、标记、杂交等多种反应
2.操作程序      
DNA溶液(100μl)1
↓← 400μl吸附液
↓← 30μl磁珠2)
↓不时用漩涡混合器搅拌,并放置约1~2min(室温)
B/F(固/液)分离3
↓←(600μl洗净液)4
↓漩涡混合器搅拌10sec,
B/F分离。3
↓←1ml75%乙醇4
↓漩涡混合器搅拌10sec,
B/F分离。3
瞬时高速离心,彻底去除上清部分。
(打开小型试管的盖子,55℃下放置5min,干燥)4
↓←25~100μl蒸馏水
↓漩涡混合器搅拌10sec,
(在无法充分将粒子分离的情况下,请用pipetting来分离粒子。)
↓放置2min
B/F分离,回收上清液。5
1)请尽量不要含矿物油。
2)使用磁珠前,请彻底悬浊混合后再使用。
3)将试管放置在磁性台架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持续去除
上清部分。通过乙醇清洗时,可以通过将上清液倒入其他容器进行去除。
B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架,但也可用简易台式离心机,用大约6,000r.p.m程度,5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化,所以请调整旋转数,使得能更有效地集合粒子,并保证凝结不至于过度。
4)请参照3.的表。
5)回收液中少量混入的磁珠并不会有碍下一次的反应,但在测定吸附度
等场合时,请通过瞬时高速离心除去磁珠。
 
3.关于工序的省略,纯化规模
·洗净工序,加热工序可以省略(请参照下表)
用途
洗净
干燥
备注
洗净液
75%乙醇溶液
测序,限制酶反应,连接反应等的前处理
1
标准操作程序。回收的核酸能用于Low Buffer系列的限制酶切断。
盐的混入会产生影响的场合
2
吸附液和洗净液含有高浓度的盐分。
乙醇的混入会产生影响的场合
1次(2次)
55℃,5min
用于易受乙醇影响的前处理。
要去除混入的酶的场合
1
1次(2次)
用于去除碱性磷酸酶等。
要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合
1
2
吸附液内含有能吸收紫外线的物质。
 
·根据DNA溶液的量,可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
液和磁珠的使用量。此时,无需减少75%乙醇溶液的使用量。
[6] 回收琼脂糖凝胶
 1.前言
·本操作程序适用于从TAE或者TBE琼脂糖凝胶(约0.3g)中回收
DNA片段。本操作程序是以琼脂糖浓度2%以下的凝胶为对象。
要使用2%以上的凝胶时,推荐所使用凝胶的量少于0.3g。另外,本
操作程序不需要使用特殊的低融点琼脂糖凝胶。
·能够回收的DNA大小约为100bp~50kbp。
·回收后的DNA主要用于连接反应、标记、测序等反应。
 
2.操作程序
琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。
在UV照射下(Long wave),为了使得目标条带尽可能地变小,使
用切割刀或手术刀等进行切开。
把切开的琼脂糖切细,放到1.5ml小型试管中。(此时称得重量,如
果大于0.3g则分几次进行。)1
↓←400μl吸附液
在凝胶完全溶解之前,将其放置在室温中,并不时进行搅拌。2
↓←30μl磁珠3
↓经常用漩涡混合器搅拌,并放置2min(室温),
B/F分离。4
↓←600μl洗净液
↓漩涡混合器搅拌10sec,
B/F分离。4
↓←1ml75%乙醇溶液5
↓漩涡混合器搅拌10sec,
B/F分离。4
瞬时高速离心,彻底去除上清部分。
(打开微型试管的盖子,55℃下放置5min,干燥)5

 
↓←25~100μl蒸馏水
↓漩涡混合器搅拌10sec
(在无法充分分开粒子的情况下,请用pipetting来分散粒子。)
↓放置2min
B/F分离,回收上清液6
 
1)   将琼脂糖凝胶制成切片,以利于溶解。
2)   如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或凝胶难以溶解时,请加温至55℃
5min。
3)   使用磁珠前,请彻底混合后再使用。
4) 将试管放置在磁性台架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持续去
除上清部分。要洗净乙醇,也可以通过将上清液倒入其他容器来去除。
B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架,但也可使用简易台式离心机,用大约6,000r.p.m程度,5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化,故请调整旋转数,使得更有效地集合粒子,并保证凝结不至于过度。
5) 请参照3.的表。
6) 回收液中混入少量磁珠并不会有碍下一次的反应,但在测定吸附
度等场合时,请通过瞬时高速离心除去磁珠。
 
3.关于工序的省略,纯化规模
·洗净工序,加热工序可以省略(请参照下表)
用途
洗净
干燥
备注
洗净液*
75%乙醇溶液
连接反应, 测序等
1
1
标准操作程序。
盐的混入会产生影响的场合
1
2
吸附液和洗净液中含有高浓度的盐分。
乙醇的混入会产生影响的场合
1
1次(2次)
55℃,5min
用于容易受乙醇影响的前处理。
要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合
1
2
吸附液内含有吸收紫外线的物质。
*从琼脂糖凝胶中回收核酸时,必须用洗净液清洗。

 
·根据DNA溶液的量,可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
液和磁珠的使用量。此时,无需减少75%乙醇溶液的使用量。
      
[7] 疑难解答      
 1.回收量低
原因
对策
去除乙醇不彻底
瞬时高速离心后,请仔细去除75%乙醇溶液。
溶出不充分
通过10mM Tris-HCIpH8.0),或者TE buffer能够提高溶出的效率。另外,如果加温至55℃保持2min能够更加有效地提高溶出效率。
吸附时间不合适
如果吸附过剩,回收量则会变少。最恰当的吸附时间是,对于DNA溶液为12min,对于凝胶则为2min
溶出时的搅拌不充分
溶出时,如果磁珠的混合不充分,回收量会减少。在瞬时高速离心后,磁珠会在底部结块,请仔细将其散开。特别是在从琼脂糖凝胶中进行纯化的时候,结块的磁珠会比较难以重新散开。
琼脂糖凝胶的量大于0.3g
请减少琼脂糖凝胶的量。
使用2%以上的琼脂糖
请减少琼脂糖凝胶的量。
没有用洗净液清洗
从琼脂糖凝胶中回收DNA时,请务必先用洗净液清洗。
 
2.回收的核酸的吸光度不准确
原因
对策
清洗不充分
吸附液中含有吸收紫外线的物质。要对回收的核酸定量,请用洗净液以及75%乙醇溶液来清洗。
混入了吸附液
吸附液中含有吸收紫外线的物质。请仔细去除吸附液。用面纸等擦拭试管的盖子上沾有的吸附液,可以有效改善状况。
 

 
3.回收后的核酸不能良好地进行反应
       原因
对策
盐阻碍了反应
请添加两次75%乙醇溶液进行清洗的工序。吸附液和洗净液都含有高浓度的盐分。
乙醇阻碍了反应
请按照操作程序,对乙醇进行干燥处理。
酶未能完全去除
要去除反应液中的碱性磷酸酶等酶,请用洗净液以及75%乙醇溶液进行清洗。
反应用的酵素过少
从琼脂糖凝胶中回收核酸时,反应用的酶量应比通常要多,这样就能得到准确良好的结果。
使用的琼脂糖级别不够
请使用高级别的琼脂糖。
从琼脂糖凝胶中分离条带时,受到的紫外线照射过多
请用Long wave365nm附近)的紫外线来进行切片工作。
 
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