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细胞转染操作方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2012-09-01  来源:生物在线  浏览次数:1004
核心提示: 细胞转染操作方法

转染 ,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
 
理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。
 
需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。
 
一、细胞传代
 
1. 试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。
 
2. 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。
 
3. 用Tip头加入1ml Trypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
 
4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。
 
5. 用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。
 
6. 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。
 
7. 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
 
8. 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。
 
9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。
 
二、细胞转染
 
1. 转染试剂的准备
 
① 将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。
 
② 震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。
 
2. 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。
 
3. 将混合液在室温放置10―15分钟。
 
4. 吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。
 
5. 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。
 
6. 到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
 
三、第二次细胞传代
 
1. 在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
 
2. 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。
 
3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
 
 
编辑:songjiajie2010

 
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关键词: 细胞转染
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