一）基因组DNA分离、纯化和加工

[Mbo I酶检测]

1．准备1.5ml小试管4个；每管内含有：

基因组DNA（在TE或水中） 10.0μg

10×Mbo I缓冲液 2.5μl

H2O 12.0μl

2．向每管中分别加入：0.1，0.5，1或2单位的Mbo I酶。

3．37℃保温到5，10，20，40分钟后，分别从每管中移出6μl，在干冰中贮存到下一步时一并使用。

4．把16个样品在琼脂糖凝胶中进行电泳，并与标准分子量进行比较。

5．选择参数为：能产生平均大小约20kb的时间和Mbo I的浓度。

[Mbo I酶切]

1．根据上述酶切检测结果，选用最佳酶切条件，并把酶的量加大100倍，用以消化1mg的基因组DNA；取1个10~15ml的塑料管，加入：

含1mg基因组DNA 1.0ml

Mbo I 按所测定的量加

10×Mbo I缓冲液 250.0μl

H2O 1.2ml

按前述（5）中所测定出的时间（产生20kb）于37℃保温。

2．用2.5ml 1：1酚和氯仿混合物抽提DNA.

3．把上层水相移入一新管中，加275μl 5M的NaCl。

4．加7ml乙醇，置冰水浴中沉淀10分钟。

5．4℃，12 000g离心10分钟。

6．倒除乙醇，重悬DNA于500μl TE缓冲液中，重悬过程在4℃中需数小时。

7．为获得大小合适的DNA片段，将步骤6中的DNA分作6分（每分约80μl），分别放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超离心管中，各通过蔗糖梯度密度仪。在含10~40%的蔗糖，20 mM Tris（pH7.4），10mM EDTA，1M NaCl等浓度中形成线性梯度。

8．135 000g 20℃离心16小时。

次日

9．用粗针头在每一管的底部刺一小孔（依次收集6管中的DNA）每管按12滴（350~500μl）作为一分收集入a, b, c…数管中，然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。

10． 从每分中都取10μl样品加10μl水稀释、4μl载样缓冲液、用0.4%琼脂糖凝胶电泳，然后与Hind Ⅲ酶切的λDNA标准分子量作比较，以确定那一分中所含片段为10~20kb大小。

11． 将含有16~20kb片段的管子并在一起，加2.5倍体积的乙醇，-20℃冷冻数小时。

第三天

12．10 000g 4℃离心10分钟，收集DNA。

13．弃上清液，重悬于160μl TE缓冲液中。

14．对大小合适的片段（16~20kb）再按8~13重复梯度分离，但此次只用两个管子即可；每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分离后，将沉淀的DNA悬浮在50μl TE缓冲液中。

第四天

15．取2.5μl样品（用溴化乙锭染色），与已知浓度和片段大小的DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳后，比较两者染色强度，估算出DNA浓度，并确证所制备出插入片段的不同大小。

16．把样品DNA浓度调到0.25μl/ml，-20℃贮存备用。

二）用于基因克隆载体DNA（噬菌体DNA）的制备

1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA，加：

EBML3 DNA(500μg) 500μl

10×BamH I缓冲液 100μl

BamH I (10U/μl) 100μl

H2O 300μl

2. 于37℃保温2小时。

3. 每管中加1体积（500μl）SS-酚和氯仿（1：1）混合物。充分混匀，于微型离心机中离心2分钟以分离两相，吸取上清水相至新管。

4. 在每管中加500μl氯仿，充分混匀，离心2分钟，分相。

5. 吸水相转入新管。

6. 在各试管中加50μl 5M NaCl，再加1ml乙醇。冰水浴中冷却10分钟。

7. 在微型离心机中4℃离心5分钟。

8. 弃去上清液，加1ml 80%乙醇洗涤沉淀物，离心弃去液体。

9. DNA沉淀物真空干燥。

10. 用500μl TE缓冲液溶解沉淀物。

11. EcoR I酶切EBML3 DNA，加：

从步骤10中所获DNA 500μl

10×EcoR I缓冲液 100μl

EcoR I (1 000U) 100μl

H2O 300μl

12. 于37℃保温4小时。

13. 按3-9抽提、沉淀并回收。

14. 用500μl TE缓冲液溶解沉淀物。

15. 异丙醇沉淀：在步骤14中得到的500μl DNA于1.5ml离心管中加：3M 醋酸钠（pH6.0）75μl，异丙醇（在1.5ml微型离心管中）300μl。

16. 冰水浴中置15分钟。

17. 在微型离心机中4℃离心10分钟。

18. 弃上清液，用200μl 0.35M醋酸钠和乙醇（1：2.5）溶液洗涤沉淀物。

19. 在微型离心机中4℃离心10分钟。

20. 重复步骤18和19。

21. 弃去上清液，真空干燥沉淀物。

22. 以0.5μg/μl浓度溶解于TE缓冲液中。

23. -20℃保存备用。

三）基因组DNA和载体噬菌体DNA的连接和包装

1．可按下列步骤在5个1.5ml的小离心管中（用笔标记上从A到E）加入下列试剂：10×连接酶缓冲液1.0μl，载体臂DNA（0.5μg/μl）2.0μl。

2．再往每管中加：

 A
 B
 C
 D
 E
 
Mbo I插入片段（0.25μg/μl）
 -
 1μl
 2μl
 3μl
 4μl
 
H2O
 6μl
 5μl
 4μl
 3μl
 2μl
 
T4 DNA连接酶
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 
每管总量10μl
 
 
 
 
 
 

3. 令其充分混合，离心，于14℃保温12~16小时，连接物可在-20℃下保存备用。

4. 包装方法：为简便起见，可购买包装抽提物。各管子中的10μl连接液都用于包装，按产品说明书进行操作。包括将连接物和包装抽提液混合，然后22℃保温2小时。

5. 包装混合液用TMG缓冲液稀释至250μl，包装后的DNA于4℃保存，切勿冷冻。

6. 取等分稀释液，倒平板，确定建库的最适比例；然后按最适比例一系列连接和包装反应，再合并。构建文库要测效价和倒平板，以便供筛选和扩增之用。

四） 测效价和制备文库平板

1．取500ml消毒培养瓶，注入100ml消毒LB培养液，再接种入2ml含有新鲜LE392细菌的麦芽糖液，培养至OD600近1.0。

2．收集细胞分别于两个带螺旋帽50ml聚苯乙烯管中；2500g离心10分钟。

3．弃上清，把每一沉淀物重悬入25ml消毒的10mM MgSO4中。

4．LE392细胞在4℃中可存两周；贮存过长会降低接种存活率。

5．接种噬菌体和测效价：从每250μl包装反应液中取1μl（从前（三）中5），加入到99μl TMG中，分1μl和10μl此稀释液加入13mm（直径）×100mm（长）消毒管中；同时也稀释和铺制克隆载体平板、连接和包装，但无插入（三种A管），作为本底对照。

6．从4步骤向每管中加200μl LE392细菌，混匀，室温孵育20分钟。

7．加2.5ml含有10 mM MgSO4的上层琼脂（48℃）；在室温中把每管立即倒入琼脂平板上，旋动，令上层琼质分散均匀。

8．室温中置5分钟，令琼脂变硬，反置平板，37℃中培养8~16小时，当LE392细胞长满后，由于溶菌作用，空斑形成将非常明显。

9．计算每一包装反应效价，统计每一平板空斑数，理想浓度的插入片段的效价应是：如建立文库成功，与无插入对照文库相比，至少大5~10倍。

10． 放大：如需放大，应用足够反应样品去建库，在最适条件下重复连接和包装反应，但不扩大反应规模；对哺乳动物基因组，理想的目标文库大小是1~2×106噬菌斑，合并包装混合物，并通过倒平板计算噬菌斑数，用来测定其效价，或文库的含量。

11． 以下7个步骤是倒平板供文库筛选，如果筛选前要扩增文库，则可按六、文库扩增法进行，然后再回到步骤12。

12． 文库倒平板筛选：要筛选5×105~106噬菌斑，一般每个90mm LB琼脂平板上有104噬菌体；先取20ml LE392细胞；装入50ml无菌带帽塑料试管中，在细菌中加入已知效价的包装混合液5×105~106噬菌斑，混合。

13． 室温中置20分钟，令噬菌体附到细胞上。

14． 在50~100个13×100mm的无菌玻璃试管中各加200μl受吸附的细菌。

15． 室温下每管各加2.5ml 48℃融化的无菌LB上层琼脂糖，并立即倒在LB琼脂平板上，摇动使之分布均匀，连续倒完全部平板。

16． 室温下置15分钟，使上层琼脂糖凝固，于37℃倒置培养8~16小时。

17． 此间将出现噬菌斑。

18． 4℃保存平板。

五） 用放射性探针筛选已倒平板的文库

1. 将琼脂平板翻转，令琼脂面下，去掉培养皿盖，在室温中空气干燥30分钟。

1．给每个培养皿编号，用笔在对应的NC滤膜上编号。

2．把滤膜小心地铺在琼脂平板上，编号朝上，滤膜0.5~1分钟内变湿，持续20分钟使噬菌斑吸附到NC滤膜上。

3．用一根干净的18号针头穿过滤膜和琼脂糖，戳5~10个孔，使滤膜在琼脂糖膜上定位（此步很重要）。

4．用扁钳小心缓慢从平板上揭下滤膜，注意不要掀起含噬菌体的琼脂糖层，用记号笔在培养皿底部标记针孔。

5．令号码面朝下，在室温中置30分钟让滤膜干燥，每个平板可再影印第2张滤膜，此对消除假阳性信号很有用，因所有的真阳性应在两张膜的同一位置上杂交，另外，第二张滤膜也可用第二种探针杂交。

6．将滤膜相继浸入100ml下列3种溶液中（30~60秒/每次）：

a. 0.2M NaOH，1.5M NaCl

b. 2×SSC，0.4M Tris pH7.4

c. 2×SSC

每浸润25张滤膜后更换一次溶液

7．硝酸纤维素膜面朝上，放置在Whatman 3mm纸上，室温种干燥1小时。

8．80℃真空干燥2小时。

9． 用杂交缓冲液湿润所有滤膜，切口平移的探针用缓冲液-N，合成探针用缓冲液-S。

10． 在1只1L烧杯中，放入滤膜和足够量的杂交缓冲液，浸泡滤膜。

11． 准备杂交探针：将比活性为108cmp/μg的切口平移探针0.25μg加到1个带螺纹帽的50ml试管中，加0.5ml 2mg/ml的鲑鱼精子DNA溶液，再依次加入下列溶液并振荡混合使其变形：10M NaOH 50μl; 2M Tris pH7.4 300μl; 1M HCl（延壁加）500μl。

12． 将此变性的探针加到放有滤膜和缓冲液的烧杯中，旋转均匀。

13． 于42℃振荡（轻轻摇动）4~16小时，使切口平移探针杂交（合成探针的保温温度不同）。

14． 倒出烧杯中的杂交缓冲液，用500ml含0.1%SDS(W/V)2×SSC溶液在室温中摇动15分钟。

15． 按步骤15再洗两次，低盐洗涤前用吸水纸吸干所有滤膜。

16． 用含0.1%SDS(W/V)0.1×SSC 500ml，52℃洗涤滤膜两次，每次15分钟。

17． 倒去洗涤缓冲液，用Whatman 3mm滤纸吸干滤膜，在空气中干燥1小时。

18． 将NC滤膜贴在3mm滤纸上，用放射性墨水标记3mm滤值；滤膜用干净塑料纸包好，用增强屏在XAR-5底片下于-70℃曝光过夜，检测阳性信号。

第二次筛选

19． 将200μl LE392指示菌加到13×100mm试管中。加2.5ml含10mM MgSO4的48℃ LB上层琼脂，室温下立即倒入90mm的LB琼脂板上，静止5分钟使之凝固，形成细菌苔，在培养皿底划50个格子，供第二次噬菌体的生长。

20． 按照膜上放射性墨水标记与X光底片对齐，用标记笔将膜上的位置孔标记在底片上，用透射光帮助对齐。

21． 根据放射自显影信号，用牙签挑取阳性噬菌体斑或其附近噬菌体。

22． 将牙签上噬菌体斑，点在各个菌苔方格里，只要将牙签尖在菌苔上轻轻触一下即可。

23． 倒置平板，37℃培养过夜。

24． 加盖NC滤膜，筛选，按步骤1-19进行。

第三次筛选

25． 用牙签转移来自每一个原始阳性信号的第二轮单个杂交噬菌斑中的噬菌体，每个牙签可转移106~107个噬菌体颗粒。

26． 将牙签放进盛有10ml无菌TMG缓冲液的无菌管中，剧烈振荡混合，以混匀噬菌体。

27． 将步骤27的TMG混合液0.25μl和2.5μl放入两个含有200μl LE 392倒平板细胞的13×100mm管子内，加2.5ml 48℃含10mM MgSO4的LB上层琼脂，室温下立即倒在90mm的LB琼脂板上，摇动使之分布均匀，室温下凝固15分钟。

28． 倒置平板，37℃培养过夜，每个平板应形成50~500个噬菌斑。

29． 用干净牙签从100~200个单独分开的噬菌斑中，把噬菌体转移到长有LE392菌苔的平板上。

30． 倒置平板，37℃培养过夜。

31． 按步骤1-19对格子里的噬菌体作第三次杂交和筛选。阳性信号为纯化的噬菌斑克隆，每一个来自初始阳性信号的“战胜者”，按步骤26用牙签转移到5ml TMG液。

32． 加1μl TMG混合液到200μl LE392到平板细胞中，按步骤28和29进行，37℃倒置培养过夜。

33． 此平板上所有的噬菌斑，都是该克隆的纯化噬菌斑，这平板可用Parafilm封柱，贮于4℃中，作为克隆的原种。平板上的单个噬菌斑，可直接用于这种噬菌体生长的制备。

六）文库扩增

1．每2×104文库中的噬菌体在一个无菌的13×100mm试管中同200μl LE392细胞混合。一般说，扩增2×106个噬菌斑的文库需100个试管，室温下吸附培养20分钟。

2．在每个试管中加入含10mM MgSO4 48℃的软琼脂2.5ml室温下立即倒在90mm的LB琼脂板上，摇动铺匀，不要倒转平板，否则琼脂会滑到一边，37℃培养6~10小时。

3．当噬菌体开始形成针尖状噬菌体斑，而尚未变大连接成片时，加2ml LB培养液，用无菌塑料棒或弯曲的移液玻璃管从平板上刮下软琼脂，装入一个无菌的1L烧杯中，每100ml体积平板上刮下的软琼脂中加2ml氯仿。

4．在一末端为圆锥形的无菌离心管中，3000g离心混合物10分钟，琼脂和细菌碎片将在管底形成沉淀，轻轻倒出含有扩增文库的上清液。

5．测定文库体积：加NaCl晶体至种浓度为1M。

6．稀释和倒平板，以测定扩增文库效价，标准的效价为每1ml 5×109~1010个噬菌体。

7．将文库分装在1ml无菌管中，每管加3滴氯仿，4℃贮存。

8．在倒平板和筛选前再测定文库效价。