杂交反应的条件类似于传统的Southern或Northern杂交。具体的选择视研究目的而定，例如，进行多态性分析或杂交测序时，要求能够区分单个碱基的变异，所以需要较高的杂交严谨性；而用于表达谱检测的芯片为了提高检测的特异性、保证较高的灵敏度，需要较长的杂交时间，高的严谨性、高的样品浓度、较低的杂交温度等。同时，杂交反应还必需考虑反应液中的盐浓度、探针序列的G C含量、探针所带电荷情况、探针与芯片片基间连接臂的长度及种类，靶序列二级结构等因素。固定于芯片表面的探针或蛋白、多肽分子与位于液相的靶分子进行生化反应（作用）的过程不完全与液相中生化反应相同。其原因在于，生物大分子与固相支持物的结合导致了溶液中的靶分子与其不能迅速地发生作用，延长了反应时间，必要时还必需提高靶分子的浓度以加快反应。而且，固相化的大分子，特别是空间体积较小的分子，很容易受到支持物对生化反应的空间阻碍作用。如何解决以上问题是生物芯片技术应用中的关键之一。 有研究表明，在探针分子与片基间加入适当长度的连接臂可使杂交效率提高上百倍。连接臂将固相化的探针分子与支持物隔开一定的距离，减少空间阻碍作用。另外，不带电荷的肽核酸(PNA)也可与DNA形成PNA-DNA杂交体，且比DNA-DNA或DNA-RNA杂交体更为稳定的，防止核酸二级结构对杂交反应的影响，所以适合进行单个碱基错配的分析。PNA还能够抵御蛋白酶与核酸酶的降解，具有很高的稳定性[4]。目前由于PNA合成难度较大、成本高尚未得到大量的应用。为加快杂交反应速度，美国Nanogen公司研制的电子芯片通过在杂交位点引如电场而使杂交和冲洗过程速度大大增加。它在1mm2的位点上制作有微电极阵列，其上覆以链亲和素标记的琼脂糖[5,6]。生物素标记的探针分子可快速地结合到位于电极上方的琼脂糖上，从而提高了杂交速度。其原理为:当位于待检位点链亲和素标记的琼脂糖凝胶下方的微电极引入直流正电压后，溶液中的生物素标记化的探针就可在电场的作用下快速泳动并浓缩结合于该处。同样的道理，可以使待检的DNA分子快速浓缩于此，从而有力地杂交反应迅速进行。杂交完成后，改变电场方向、可将未杂交的样品DNA从检测位点“洗”去，选择适当的电场强度就可以使非特异杂交的DNA与未杂交的探针选择性地从特定位点分开除去，而保留完全杂交的DNA分子。由于电场的这种浓缩和选择特性，使得该方法有很高的灵敏度和特异性，最重要的是它使原来数小时的杂交反应缩短到二三十秒钟。Gene Logic公司研制的生物芯片将探针分子固定与微通道内，标记后的核酸样品流过时便会浓缩富集于通道内，同样也可缩短杂交过程，提高检测的灵敏度，降低试剂消耗。