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地高辛配基随机标记DNA探针

放大字体  缩小字体 发布日期:2005-11-18  浏览次数:1443
 1.标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA,也可标记更大量的DNA,但所有的成分和体积要相应增加。

  (1)DNA探针热变性,煮沸10min,迅速冷却于冰/乙醇中5min以上,待用。
  (2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及试剂:
  新鲜变性的DNA          1-3μg
  六聚核苷酸混合物         2μl(管5)
  dNTP标记用混合底物        2μl(管6)
  加无菌重蒸水至          19μl
  DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)   1μl(管7)
  (3)在37℃保温至少60min,可到20h。
  (4)煮沸5min,终止反应。
  (5)15000rpm离心30s,置于冰上待用。

  2.预杂交 按100cm2膜用20~40ml预杂交溶液,预杂交时使溶液处于流动状态。
  预杂交液组成:5×SSC
  0.5%(W/V)封阻试剂(管11)
  0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠
  0.02%(W/V)SDS
  膜放入塑料袋,灌入预杂交液,排除气体后密封,在65℃预杂交过夜。

  3.杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液,杂交时偶尔摇动杂交袋,使里面的溶液重新分配。
  杂交液组成: 50%甲酰胺(V/V)
  5%(W/V)封阻试剂
  5×SSC
  0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠
  0.02%(W/V)SDS
  新变性标记DNA(150ng/ml)

  杂交液取代预杂交液,替换间膜不能干,成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜(16~20h)。

  4.洗膜  按100cm2膜用250ml洗膜液计算。
  (1)在室温下用2×SSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。
  (2)在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。
  (3)在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。

  5.免疫测定

  (1)配制溶液
  缓冲液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)
  缓冲液2:0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50~70℃,此溶液保持混浊)。
  缓冲液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
  缓冲液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
  显色溶液:新鲜配制,在10ml缓冲液3中,加45μlNBT溶液(管9)和35μlX-磷酸盐缓冲液(管10)。

  2. 显色过程
  A.膜在缓冲液1中短暂洗涤(1min)。
  B.在100ml缓冲2中保温30min。
  C.再用缓冲液1短暂洗涤。
  D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。
  E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。
  F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。
  G.膜在缓冲液3中平衡2min。
  H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时,不可振荡或搅拌。
  I.当要求的点或带已被检测时,可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。
  J.摄相。
  说明:上述各反应均在室温下进行,除了显色反应外,均需振荡或搅拌。

  (五)排除实验中问题的方法

  1.DNA不能有效地被标记时考虑
  (1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀,重新纯化DNA。
  (2)标记反应的保温时间延长(增至20h)。
  (3)DNA变性或许不完全,这时对大片段DNA特别重要。

  2.不能达到预期的灵敏度时考虑
  (1)DNA标记率。
  (2)增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。
  (3)显色反应的时间可延长至3d。

  3.若显色时背景过深,可采取
  (1)在杂交溶液中减少标记DNA量。
  (2)增加杂交溶液的体积,使膜随意漂浮在溶液中。
  (3)某些类型的尼龙膜可能产生深色背景,因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
  (4)在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。

 
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