外显子捕捉
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外显子捕捉(exon trapping) 是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。捕捉外显子的载体pETV—SD是一种反转录病毒穿梭载体(shuttle vector)，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母，细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体(见图5—14)。因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体(splicing donor，SD)位点和剪接受体(splicing acceptor，SA)位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV—咀载体的克隆位点上游有一个“外显子捕捉序列”(exon trap cassette)，可用来识别载体的插入片段中有无SA位点。它含有β—珠蛋白(HBG)基因的第1个外显子及其有功能的SD位点，该基因的间隔序列(IVS)和α，β—半乳糖苷酶(αβ—GAL)基因。操作步骤及其基本原理是：
(1)基因组DNA经“霰弹法”切成小片段后，克隆在位于“外显子捕捉序列”下游的克隆位点上。
(2)将这些重组载体汇总后感染反转录病毒的专宿包装细胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2细胞系。ψ2细胞提供蛋白质产物使载体(自身不能合成病毒蛋白质)成为反转录病毒在细胞里增殖。当反转录病毒在细胞内转录时，如果插入片段中包含有功能的SA位点，则有可能发生RNA剪接反应而将IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包装在病毒子(virion)中，从细胞培养液中收集后用来感染兼宿反转录病毒包装细胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。这使反转录病毒再进行一轮复制，并产生能感染猴肾细胞系COS细胞的高效价病毒原种。这样做是由于上一轮克隆在病毒中的插入片段的剪接效率极低，而在第二轮复制时则大大提高了RNA剪接的机会。
(4)从第二个细胞系PA-317细胞中分离得到的病毒，用来感染组成型产生SV40T(肿瘤)抗原的COS细胞。病毒RNA基因组被反转录，并在载体上的SV40复制起点作用下，以环状DNA附加体形式进行复制。
(5)从COS细胞中回收复制的附加体DNA，经限制性内切酶Dpn I 酶切后转化细菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培养基上挑选转化子。卢—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成蓝色产物。因此，不产生β—半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。
(6)只挑选出白色菌落作进一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二种原因。一是由于基因发生突变，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反转录病毒生活周期的RNA时期中发生了剪接反应，从而丢失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(7)如果是基因突变，则大多数将是缺失了载体中的“外显子捕捉”部分，就可用人的口—珠蛋白基因片段为探针作菌落杂交，很快可得到验证。
(8)如果是真正发生了RNA剪接事件，准确的剪接反应可切除作为标记的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外显子与落入了捕捉陷阱的插入片段中的外显子序列连接，这可直接测定其序列加以证明。
从捕捉到的外显子出发，就可进一步用作探针去从基因组基因文库或cDNA文库中分离出基因。
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| Tag: 捕捉 病毒 细胞 基因 载体 反转 RNA 片段 序列 复制 克隆 |
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